動(dòng)物組織中苯并咪唑類藥物多殘留ELISA方法的建立

陳 飛，萬(wàn)宇平 *，馮 靜，劉春雪

（1.山東春雪食品有限公司，山東 萊陽(yáng) 265200；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

苯并咪唑類藥物（Benzimidazoles）具有廣泛的生物活性，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)各種寄生線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)具有很強(qiáng)的驅(qū)殺作用，目前在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。常用的苯并咪唑類藥物包括阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑[1-2]。但由于苯并咪唑類藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顯示致畸和致突變作用，且在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物亦有毒理作用，是食品殘留中重要的監(jiān)控對(duì)象。中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家或地區(qū)將苯并咪唑類藥物列入限制使用的藥物和動(dòng)物源性食品殘留檢測(cè)的監(jiān)控對(duì)象，并制訂了各種苯并咪唑類藥物（包括其某些代謝物）在不同動(dòng)物體內(nèi)（包括肌肉、組織等）的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL），在不同的動(dòng)物和不同的組織中最大殘留限量從10μg/kg～5mg/kg不等[3-4]。

目前對(duì)于苯并咪唑類藥物的分析方法較多，主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometr，HPLC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）及高效毛細(xì)管電泳法（highperformance capillary electrophoresis，HPCE）等[4-12]。氣-質(zhì)聯(lián)用法需要衍生化后測(cè)定，液-質(zhì)聯(lián)用儀設(shè)備較昂貴，反相高效液相色譜法則作為主要的分析技術(shù)，然而理化方法存在復(fù)雜、繁瑣、需要專業(yè)技術(shù)人員和專業(yè)技能、檢測(cè)成本高等問(wèn)題，不能實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速檢測(cè)分析；ELISA以其靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合于大量樣品的快速篩選。本研究基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)建立一種靈敏、快速檢測(cè)動(dòng)物組織中苯并咪唑類藥物的多殘留檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟苯咪唑、丙氧咪唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、丙硫咪唑亞砜、芬苯達(dá)唑、多菌靈藥物標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙酸乙酯、甲醇及其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純：購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；包被原（苯并咪唑類藥物半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物）、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株為北京勒邦生物技術(shù)有限公司制備保存。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機(jī)：上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；2000SBL電子天平：美國(guó)Setra公司；QL-901漩渦混合器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke TDL-40B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；微量移液器（單道20μL～200μL、100μL～1000μL，多道250μL）：美國(guó)Thermo公司；DHP-600生化培養(yǎng)箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化

采用方陣滴定法，確定抗原、抗體最佳工作濃度，為保證達(dá)到最佳檢測(cè)條件，對(duì)包被時(shí)間、封閉時(shí)間、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、顯色溫度時(shí)間等條件進(jìn)行篩選優(yōu)化[13]。

1.3.2 酶標(biāo)抗體的合成

采用過(guò)碘酸鈉氧化法[14]用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體，合成酶標(biāo)抗體。

1.3.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)優(yōu)化以上ELISA檢測(cè)條件，對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品曲線進(jìn)行回歸分析，建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣本前處理方法

優(yōu)化不同的試劑及提取時(shí)間，建立回收率最好的動(dòng)物組織樣本前處理方法。

1.3.5 ELISA檢測(cè)方法結(jié)果分析

采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別選擇氟苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L，以質(zhì)量濃度為0μg/L時(shí)的OD值為B0值，其他質(zhì)量濃度的OD值為B值，以百分吸光率B/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣的辦法計(jì)算樣本溶液的百分吸光率，將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯并咪唑類藥物的質(zhì)量濃度。

1.3.6 特異性試驗(yàn)

將8種苯并咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品用0.02mol/L的PBS溶解，均配制出各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行ELISA測(cè)定。按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率：

式中：X為引起50%抑制的氟苯咪唑濃度，μg/L；Y為引起50%抑制的其他苯并咪唑類藥物濃度，μg/L。

1.3.7 靈敏度試驗(yàn)

用IC50值和檢測(cè)限來(lái)評(píng)價(jià)方法的靈敏度。分別測(cè)定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50，統(tǒng)計(jì)其平均值和浮動(dòng)范圍；并測(cè)定20個(gè)空白樣本，求出其B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），方法檢測(cè)限（method detection limit，MDL）即為MDL=（）+3s。

1.3.8 添加回收試驗(yàn)

分別取空白雞肉、豬肉、牛肉樣本，以8μg/kg、16μg/kg、32μg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度的氟苯咪唑藥物對(duì)其進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，將樣本前處理后進(jìn)行ELISA測(cè)定，每個(gè)樣品做5個(gè)平行，計(jì)算添加回收率和變異系數(shù)。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將足量的ELISA方法涉及到的各種試劑及酶標(biāo)板保存于37℃環(huán)境中，每隔1d取出適量，分別測(cè)定零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、IC50，及按1.3.8所述方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)所測(cè)得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開(kāi)始下降為止，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測(cè)方法的建立

2.1.1 酶標(biāo)板的制備

通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，用包被緩沖液將包被原稀釋每孔加入100μL，37℃避光孵育2h，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌1次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150μL封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

2.1.2 樣本前處理方法的建立

雞肉、豬肉樣本的前處理：稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)物至50mL 聚苯乙烯離心管中，加入7.7mL 乙酸乙酯和0.3mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)至混勻；3000×g以上、室溫（20℃～25℃）離心5min；移取1mL 上層有機(jī)相至10mL干凈玻璃試管中，于50℃～60℃水浴氮?dú)?空氣流下吹干；加入2mL 復(fù)溶工作液渦動(dòng)30s，取50μL用于分析。

牛肉樣本前處理方法：稱?。?.0±0.05）g用均質(zhì)器均質(zhì)的樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；加入7.3mL乙酸乙酯和0.7mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)至均勻。3000×g以上、室溫（20℃～25℃）離心5min；移取1mL上層有機(jī)相至10mL 干凈玻璃試管中，于50℃～60℃水浴氮?dú)?空氣流下吹干；加入2mL復(fù)溶工作液，渦動(dòng)30s；取50μL用于分析。

2.1.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，建立ELISA檢測(cè)步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。向制備好的酶標(biāo)板中加入系列濃度的氟苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL/孔，再加入酶標(biāo)抗體50μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后加入底物液A液（過(guò)氧化脲）50μL/孔，再加入底物液B液（四甲基聯(lián)苯胺）50μL/孔，25℃顯色15min加入2mol/L H2SO4終止液，50μL/孔，設(shè)定酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定每孔吸光度值（OD值）。

2.1.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，選擇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度0μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、4.0μg/L、8.0μg/L，以百分吸光率（B/B0）為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。以lg（B/B0）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，將圖1轉(zhuǎn)換后可知，在0.5μg/L～8.0μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，lg（B/B0）與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2），得回歸方程y=-2.769x+0.539，R2=0.9980，IC50為1.5μg/L。

圖1 苯并咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of benzimidazoles

圖2 苯并咪唑類藥物競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve for detection of by ELISA

2.2 ELISA檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 特異性

交叉反應(yīng)率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，選用的單克隆抗體對(duì)苯并咪唑類藥物中的氟苯咪唑、丙氧咪唑、甲苯咪唑、阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑均有50%以上的交叉反應(yīng)率，采用此單克隆抗體建立的ELISA方法可以用于動(dòng)物組織中的苯并咪唑類藥物的多殘留檢測(cè)。

表1 苯并咪唑類藥物的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of benzimidazoles

2.2.2 靈敏度試驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50平均值為1.2μg/L，浮動(dòng)范圍為0.9μg/L～1.5μg/L；20個(gè)空白樣本的B/B0在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度的平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）見(jiàn)表2。綜合考慮幾種樣本的檢測(cè)限數(shù)據(jù)，得本方法對(duì)動(dòng)物組織中苯并咪唑類藥物的檢測(cè)限為8μg/kg。

表2 方法檢測(cè)限（n=20）Table 2 Detection limits of ELISA method（n=20）

2.2.3 添加回收試驗(yàn)

ELISA 測(cè)定的準(zhǔn)確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示。以空白雞肉、豬肉、牛肉樣本為試驗(yàn)材料，向其中分別添加氟苯咪唑藥物標(biāo)準(zhǔn)品，添加質(zhì)量濃度為8μg/kg、16μg/kg、32μg/kg，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 ELISA方法的精密度和準(zhǔn)確度Table 3 Precision and accuracy test of the ELISA

結(jié)果表明，動(dòng)物組織中氟苯咪唑藥物回收率范圍為79.8%～100.5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確性較高；變異系數(shù)范圍為7.2%～9.5%，均小于15%，說(shuō)明方法精密度（重復(fù)性）較好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將ELISA方法涉及到的各種試劑放置于37℃保存15d，每隔1d取出，測(cè)定靈敏度和回收率等參數(shù)。經(jīng)測(cè)定，涉及到的各種試劑能在37℃條件下穩(wěn)定保存測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。一般來(lái)講，在37℃每穩(wěn)定1d，可相當(dāng)于4℃～10℃保存一個(gè)半月[15]，在實(shí)際應(yīng)用中，試劑盒一般存放在2℃～8℃冰箱，所以對(duì)于整體試劑盒的穩(wěn)定性評(píng)判，還需要進(jìn)行2℃～8℃放置保存試驗(yàn)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、一次性檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)，能夠更好地滿足我國(guó)畜禽養(yǎng)殖戶、食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門(mén)等開(kāi)展檢測(cè)工作。本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的單克隆抗體為基礎(chǔ)，初步建立了動(dòng)物組織中苯并咪唑類藥物多殘留檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的IC50浮動(dòng)范圍為0.9μg/L～1.5μg/L，動(dòng)物組織樣本的檢測(cè)限為8μg/kg；樣本添加回收率為79.8%～100.5%，變異系數(shù)為7.2%～9.5%；可用于檢測(cè)多種苯并咪唑類藥物，并且樣本前處理簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備投資少、檢測(cè)成本低，適合于大批量樣本中苯并咪唑類藥物殘留檢測(cè)的快速篩選。

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