響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取昆侖雪菊原花青素的工藝研究

賀 翠，王燕芳，馬 超，謝 利，魯小靜，吳 瑛*

（1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

昆侖雪菊（Kunlun chrysanthemum）為菊科（Asteraceae）金雞菊屬（CoreopsisLinn）多年生草本植物兩色金雞菊（C.tinctoria），其維語(yǔ)名稱為古里恰依（Gulqai），生長(zhǎng)在新疆和田海拔3200m～5000m以上的高寒山區(qū)環(huán)境中生草本植物[1]。昆侖雪菊被新疆維吾爾醫(yī)院作為一種維藥材應(yīng)用，具有清熱毒、胃健脾之功，當(dāng)?shù)鼐用癜牙鲅┚债?dāng)花茶飲用[2]，昆侖雪菊可藥食兩用，有較大的市場(chǎng)前景。

原花青素[3-6]是昆侖雪菊中的次生代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗氧化能力，能夠抑制血小板凝聚及脂質(zhì)過(guò)氧化，提高人體免疫力和防御紫外線輻射[7-8]。原花青素可開發(fā)為用于防治心腦血管疾病的藥物，近年來(lái)成為某些疾病抑制的研究熱點(diǎn)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊（樣品由新疆和田陽(yáng)光沙漠玫瑰有限公司提供，陰干，粉碎，過(guò)60目篩。

1.2 儀器與設(shè)備

S54紫外分光光度計(jì)：上海棱光有限公司；SY-500超聲波萃取儀：上海寧商超聲儀器有限公司；CP224C 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于天津晶純實(shí)業(yè)有限公司，硫酸鐵銨，甲醇，正丁醇，濃鹽酸等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用鐵鹽催化比色法[10-11]。準(zhǔn)確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用甲醇溶解置于100mL容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL、1.1mL、1.2mL定容至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。分別準(zhǔn)確移取1.0mL以上溶液于10mL具塞試管中，加入9.0mL比為83∶6∶1的正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨反應(yīng)混合液，混勻，置于沸水浴中加熱40min后，立即取出冰浴冷卻4min，取出后恢復(fù)至室溫，同樣處理的甲醇為空白調(diào)零，在測(cè)定A550nm。

1.3.2 原花青素的含量測(cè)定

精密稱取昆侖雪菊粉末1.000g于6個(gè)50mL圓底燒瓶中，分別加入萃取液在不同條件下提取。每次提取液過(guò)濾3次，將濾液合并，定容于50mL容量瓶中，再?gòu)钠渲腥〕?mL于10mL具塞試管中，測(cè)定提取液中原花青素的含量。提取率計(jì)算公式：

式中：C 為濃度，mg/mL；V 為體積，mL；D 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)[8]

精密稱取昆侖雪菊粉末1g于6個(gè)50mL圓底燒瓶中，分別加入萃取液在不同條件下提取。每次提取液過(guò)濾3次，將濾液合并，濃縮后定容于50mL容量瓶中，測(cè)定提取液中原花青素的含量。分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、料液比、鹽酸用量等因素對(duì)昆侖雪菊原花青素提取率的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)[13-14]

運(yùn)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[15]確定最佳提取工藝，因子水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

以A550nm為縱坐標(biāo)，原花青素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：y=1.784x+0.0094，r=0.9994，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0～1.2mg/mL有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素提取率影響Fig.2 Effect of ethanol fraction on proanthocyanidins extraction rate

從圖2可以看出，當(dāng)料液比為1∶20、超聲功率為35W、鹽酸用量為3.5mL時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率相應(yīng)提高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%vol時(shí)提取率最高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%vol時(shí)，原花青素提取率逐漸降低，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.2.2 料液比對(duì)原花青素提取率的影響

圖3 料液比對(duì)原花青素提取率影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on proanthocyanidins extraction rate

從圖3可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲功率為35W、鹽酸用量為3.5mL時(shí)，隨著料液比的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率相應(yīng)提高，料液比為1∶20時(shí)提取率最高。當(dāng)料液比為高于1∶20時(shí)，原花青素提取率變化趨勢(shì)趨于穩(wěn)定，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取料液比為1∶20。

2.2.3 超聲功率對(duì)原花青素提取率的影響

從圖4可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶20、鹽酸用量為3.5mL時(shí)，昆侖雪菊原花青素的提取率隨超聲功率的增加而得到相應(yīng)提高，超聲功率為40W時(shí)提取率最高。當(dāng)超聲功率高于40W時(shí)，原花青素提取率趨于穩(wěn)定，考慮到能耗問(wèn)題，選擇昆侖雪菊原花青素的最佳提取超聲功率為35W。

圖4 超聲功率對(duì)原花青素提取率影響Fig.4 Effect of ultrasoud power on proanthocyanidins extraction rate

2.2.4 鹽酸用量對(duì)原花青素提取率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶20、超聲功率為35W時(shí)，隨著鹽酸（0.1mol/L）用量的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率增加，當(dāng)鹽酸用量高于3.5mL時(shí)，原花青素提取率降低，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取鹽酸用量為3.5mL。

圖5 鹽酸用量對(duì)原花青素提取率影響Fig.5 Effect of hydrochloric acid content on proanthocyanidins extraction rate

2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken中心試驗(yàn)方案進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，其結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

按照Box-Behnken中心試驗(yàn)原理，利用Design-Expert 7.1.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，其結(jié)果見表2。通過(guò)回歸分析可得出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，獲得提取昆侖雪菊原花青素的多元二次模擬回歸方程：y=1.69+0.042A+0.35B-0.05C+0.033D-0.18AB+0.12AC-0.17AD+0.097BC+0.19BD-0.12CD-0.27A2-0.54B2-0.27C2-0.13D2。決定系數(shù)R2=0.929，說(shuō)明該模擬方程的擬合度較好[16-17]。

本試驗(yàn)采用F檢驗(yàn)方法對(duì)模型的顯著性進(jìn)行分析，回歸方程的方差分析結(jié)果（見表3），其二次響應(yīng)面回歸模型F值為13.170，并且p＜0.0001說(shuō)明該方程模型極顯著，可預(yù)測(cè)對(duì)不同萃取條件下原花青素的提取率。方程式中，一次項(xiàng)，二次項(xiàng)，交互項(xiàng)均與響應(yīng)值回歸關(guān)系顯著，其中B、A2、B2、C2對(duì)原花青素的提取率的影響為差異極顯著（p＜0.01），AB、AC、AD、BD在p＜0.05水平顯著，其余項(xiàng)均不顯著。該模型失擬項(xiàng)p值0.2383，大于0.05，模型失擬不顯著，說(shuō)明該模型有效，預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2=0.9290，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.8590，說(shuō)明兩者存在高度相關(guān)[18]，因而該模型擬合度比較好，運(yùn)用該模型可以較好地分析響應(yīng)值的變化。從響應(yīng)面回歸方程F檢驗(yàn)值可以得出，影響昆侖雪菊原花青素提取率大小的因素依次為料液比（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）＞鹽酸用量（D）＞超聲功率（A）。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

圖6～圖8是原花青素提取率響應(yīng)值與相對(duì)應(yīng)的影響因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、超聲功率（A）、料液比（B）、鹽酸用量（D）交互作用構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面與等高線圖，圖6～圖8中曲面顏色越深，說(shuō)明對(duì)原花青素提取率的影響越顯著，等高線形狀越趨向于橢圓形交互作用越顯著。結(jié)果得出料液比和超聲功率，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，鹽酸用量和料液比，鹽酸用量和乙醇體積分?jǐn)?shù)這4組因素的交互作用顯著，原花青素的提取率在一定程度上會(huì)隨著4個(gè)因素的增加迅速增大，當(dāng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)所取各因素中心值時(shí)，提取率又會(huì)隨這4個(gè)因素的增加而下降，整體呈現(xiàn)拋物線形狀[19]。

圖6表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，鹽酸用量為3mL，超聲功率不變的情況下，隨著料液比的增加，昆侖雪菊中原花青素的提取率迅速增大，而后逐漸下降[20]。

圖7表明，當(dāng)鹽酸用量為3.5mL，超聲功率為35W，料液比不變的情況下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，原花青素的提取率逐漸增加。

圖6 料液比與超聲功率對(duì)原花青素提取率影響響應(yīng)面與等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour map of effect of interaction between material/liquid ratio and ultrasonic power on proanthocyanidins yield

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)原花青素提取率的影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour map of effect of interaction between ethanol volume fraction and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

圖8表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定在60%，超聲功率固定35W，料液比不變的情況下，原花青素的提取率會(huì)隨鹽酸用量的增加而提高。

圖8 鹽酸用量與料液比對(duì)原花青素提取率影響響應(yīng)面與等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour map of effect of interaction between hydrochloric acid dosage and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

2.4 工藝條件和驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Desigh Expert軟件得到最佳工藝條件為提取超聲功率35W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶20，鹽酸用量3.5mL在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。昆侖雪菊原花青素平均提取率為1.76%（n=3，RSD=1.68%），與理論預(yù)測(cè)值1.79%相比，其相對(duì)誤差約為0.03%，且重復(fù)性很好，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化昆侖雪菊原花青素最佳提取工藝條件為超聲功率為35W、料液比為1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、鹽酸用量為3.5mL，實(shí)際提取率達(dá)到理論預(yù)測(cè)值的98.324%。

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