火棘果酒在釀制過程中化學(xué)成分及其抗氧化特性的變化

蔣春蘭，莊 洋，朱定國，程 超，李 偉*

（湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

火棘為薔薇科蘋果亞科火棘屬的常綠野生灌木，產(chǎn)區(qū)均有果實代糧的歷史，恩施州野生火棘產(chǎn)量不低于10萬t。作為天然的野生果樹資源，火棘果是加工果汁、果酒的上佳原料。丁筑紅等[1]嘗試?yán)没钚愿山湍羔勚聘尚突鸺疲〉昧藵M意的效果；李勝敖等[2]將火棘鮮果壓榨后，接種酵母發(fā)酵，制得酒精度為12%vol的火棘發(fā)酵酒。趙曉明等[3]將火棘果經(jīng)全汁低溫發(fā)酵成火棘果酒，具有飲用滋補雙重作用。王憲偉等[4]利用大曲將火棘果汁和糯米一起發(fā)酵釀造制備火棘黃酒，酒體鮮甜醇厚。李新社等[5]將火棘果汁利用安琪活性干酵母經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵生產(chǎn)醋飲料。周文斌等[6]以火棘果為主要原料，經(jīng)過酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工序得到火棘果醋。雖然已有一些科研工作者對火棘果酒等發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，但是在這些研究中，均未涉及發(fā)酵過程中參數(shù)調(diào)節(jié)對生物活性成分含量及其活性的變化的影響。因此本文重點研究發(fā)酵條件（如發(fā)酵溫度、接種量、糖的添加量等）對生物活性成分及生物活性的影響，為進一步開發(fā)恩施豐富的火棘資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

火棘果：采自于湖北省恩施市龍洞河顆粒飽滿、顏色鮮紅的成熟火棘果實。

1.2 實驗試劑

蘆?。ā?5%）：西安艾沃生物科技有限公司；安琪活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、水溶性維生素E（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox）、三吡啶三吖嗪（ferric-tripyridyl-triazine，TPTZ）：日本TCI公司；OPA、碳酸鈉、氫氧化鈉（分析純）：國家集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸氫鈉、苯酚、過硫酸鈉、四硼酸鈉（分析純）：天津常福晨試劑有限公司。

1.3 實驗儀器

UV765紫外分光光度計、FA1004B型電子天平、PHSJ-3F實驗室pH計：上海精密儀器有限公司；800型離心機：上海手術(shù)器械廠；GZC-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司；DL-5低速大容量離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；FSH-2多功能勻漿機：武漢輕工業(yè)公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 火棘果酒發(fā)酵工藝

將采集的新鮮火棘果實稱取適量，勻漿，加入20%白砂糖、1%安琪酵母和162.5mg/L亞硫酸氫鈉，混勻后分裝發(fā)酵。在測定各成分之前先取發(fā)酵液在4000r/min離心15min，然后再每隔24h進行與之重復(fù)的試驗。

1.4.2 指標(biāo)測定

（1）pH值測定：酸度計測定。

（2）酒精體積分?jǐn)?shù)的測定。

按照參考文獻[7]，酒精計法測定火棘果酒樣品的酒精體積分?jǐn)?shù)。

（3）黃酮含量測定

采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH方法[8]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，以其質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)510nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.3991x-0.0178，R2=0.9922。

發(fā)酵液中黃酮含量測定：移取0.5mL發(fā)酵上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定A510吸光度值，黃酮含量計算公式：

式中：V 為發(fā)酵液的測定體積，mL。

（4）多酚含量測定

FC法[9]：以沒食子酸為對照品，以其質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)765nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1.2676x+0.0149，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

發(fā)酵液中多酚含量測定：移取0.25mL發(fā)酵上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定A765nm，多酚含量計算公式：

式中：V 為發(fā)酵液的測定體積，mL。

（5）總糖含量測定

苯酚-硫酸法[10]測定發(fā)酵液中總糖含量，以葡萄糖為標(biāo)樣，以其質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)485nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.0086x-0.0175，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

發(fā)酵液中總糖含量測定：移取適宜濃度發(fā)酵上清液，加入1mL 9%苯酚，搖勻，加5mL濃硫酸，搖勻，靜置30min，測定A485nm。

式中：V 為發(fā)酵液的測定體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)。

（6）蛋白質(zhì)含量測定

G-250法測定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量[10]，以牛血清白蛋白標(biāo)樣為對照品，以其質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)595nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.0060x-0.0092，R2=0.9927。

發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量測定：移取0.5mL發(fā)酵上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定A595nm。

式中：V 為發(fā)酵液的測定體積，mL。

（7）游離氨基酸含量測定

OPA法[11]：精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品鄰苯二甲醛（Ortho-pathaladehyde，OPA）40mg溶于1mL 甲醇，加入2.5mL 20%的SDS溶液，再加入0.1mol/L四硼酸鈉25mL，β-巰基乙醇100μL，蒸餾水定容至50mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）。分別取0mL、0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液，再加入0.20mL、0.16mL、0.12mL、0.08mL、0.04mL、0.00mL蒸餾水，再分別加入4mL OPA溶液，搖勻。靜置3min，在波長340nm處測定吸光度值，以氨基酸濃度為x軸，吸光度值為y軸繪制曲線，算得回歸方程：y=0.0122x-0.0146，相關(guān)系數(shù)R2=0.9978。

發(fā)酵液中游離氨基酸的測定：移取0.1mL發(fā)酵上清液，加入0.1mL蒸餾水，搖勻，加入4mLOPA試劑，搖勻。靜置3min，測定A340nm。

式中：V 為發(fā)酵液的測定體積，mL。

1.4.3 抗氧化指標(biāo)測定

（1）發(fā)酵液對ABTS自由基的清除作用

用2.45mmol/L過硫酸鉀配制7mmol/L ABTS儲備液，將此用10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋至波長734nm處吸光度值為0.7+0.02，取4mL ATBS測試液，加60μL對應(yīng)的樣品提取液，反應(yīng)6min后測定A732nm，即為A對照，取4mL ATBS測試液，加60μL樣品溶液搖勻后，反應(yīng)6min后，測定A732nm，即為A樣品[12]。

（2）發(fā)酵液在FRAP體系中的還原作用

蒸餾水1mL，1.8mL TPTZ溶液，60μL樣品溶液混勻，37℃反應(yīng)10min，測定A593nm，結(jié)果以μmol/L Trolox等量抗氧化能力（TEAC）表示[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 火棘果酒釀制過程中化學(xué)成分的變化

2.1.1 pH值和酒精度的變化

在不同發(fā)酵階段分別取發(fā)酵液進行酸度和酒精度測定，pH值和酒精度隨發(fā)酵時間的變化見圖1。

由圖1可見，發(fā)酵初期，發(fā)酵液的pH值有輕微下降的趨勢，但發(fā)酵進行到第2d時發(fā)酵液pH值開始回升，最后基本穩(wěn)定在pH3.8～4.0之間。此外隨發(fā)酵過程的進行，果酒酒精體積分?jǐn)?shù)不斷增大，尤其是在發(fā)酵的第2d，火棘果酒的酒精體積分?jǐn)?shù)增幅較大，之后酒精體積分?jǐn)?shù)開始小幅上升。這主要是由于酵母利用糖類物質(zhì)產(chǎn)生乙醇。

圖2顯示火棘果酒發(fā)酵液中總糖含量逐漸下降，尤其是發(fā)酵的第1d，總糖含量大幅下降，這與發(fā)酵液中的酒精度增加是相對應(yīng)的。由圖3可以看出，隨發(fā)酵液中多糖含量降低，發(fā)酵液的酒精度逐漸增加，二者具有對數(shù)相關(guān)性。

2.1.2 黃酮和多酚含量變化

圖1 pH值和酒精體積分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Changes of pH value and alcohol content during the fermentation

圖2 多糖含量隨發(fā)酵時間的變化Fig.2 Changes of polysaccharides content during the fermentation

圖3 多糖含量與酒精度關(guān)系Fig.3 Relation between polysaccharides and alcohol content

黃酮和多酚的變化趨勢很相似，均在發(fā)酵的1d后達(dá)到最高值，之后有輕微下降，但是在發(fā)酵第4d和第7d黃酮含量均有所回升，主要原因可能是火棘果中黃酮和多酚大部分為醇溶性，隨發(fā)酵時間延長酒精體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮和多酚浸出量逐漸增加，同時火棘果發(fā)酵過程中采用通風(fēng)搖瓶發(fā)酵，這有可能導(dǎo)致發(fā)酵液中已經(jīng)浸提出的黃酮、多酚的氧化，因此在后期導(dǎo)致二者含量略有下降。這與許亮等[13]的研究結(jié)果不同，主要原因可能是不同原料中黃酮種類不同。

圖4 黃酮和多酚含量隨發(fā)酵時間的變化Fig.4 Changes of flavonoides and polyphenoles content

2.1.3 蛋白質(zhì)和游離氨基酸的含量變化

圖5 蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量隨發(fā)酵時間的變化Fig.5 Changes of protein and free amino acid content during the fermentation

由圖5可見，發(fā)酵液中游離氨基酸含量逐漸上升，可能有以下兩方面原因引起，一是火棘果原料本身的游離氨基酸在發(fā)酵過程中由于浸泡作用逐漸游離出來；二是蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生新的游離氨基酸。

蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵的2d中達(dá)到最高值，主要是火棘果發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)溶出量的增加導(dǎo)致；在發(fā)酵第3d～4d，其含量快速下降，此時發(fā)酵液的pH值維持在3.7，這有可能是此pH值達(dá)到了火棘果中部分蛋白質(zhì)的等電點而導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀，致使蛋白質(zhì)含量快速下降；5d以后呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于蛋白質(zhì)分解釋放出游離氨基酸而導(dǎo)致的。

2.2 發(fā)酵液抗氧化特性的變化

圖6 火棘果酒發(fā)酵過程中抗氧化作用的變化Fig.6 Changes of antioxidation activities during the fermentation

ABTS和FRAP法操作簡單，適合于常規(guī)實驗室大規(guī)模采用[14-15]，因此本文主要采用了這2種抗氧化指標(biāo)。由圖6可以看出，發(fā)酵液對ABTS自由基的抑制率隨發(fā)酵時間的延長逐漸增加，但是發(fā)酵液在FRAP體系的還原作用卻在1d后達(dá)到最高值，之后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。由于火棘果酒發(fā)酵液中成分復(fù)雜，因此在不同抗氧化體系中具體發(fā)揮作用的成分不同，導(dǎo)致不同抗氧化體系中發(fā)酵液的抗氧化功能的變化不同。同時由表1可看出，在FRAP體系中與發(fā)酵液的TEAC值最相關(guān)的化學(xué)成分是多酚和黃酮，達(dá)到了極顯著水平（二者prob＞F分別是0.000，0.004），發(fā)酵液的TEAC值與多糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這主要是由于多糖降解產(chǎn)生乙醇類物質(zhì)，而乙醇類物質(zhì)提高了黃酮和多酚的含量。發(fā)酵液對ABTS自由基的清除能力最相關(guān)的化學(xué)成分是多肽，達(dá)到了極顯著水平（prob＞F=0.000），其次是與黃酮和多酚相關(guān)性，其相關(guān)性的顯著性僅有0.104和0.111，未達(dá)到顯著水平，這說明火棘果酒發(fā)酵液中有可能產(chǎn)生了一些功能性的多肽類物質(zhì)，因此有待于進一步進行研究。

表1 發(fā)酵液的抗氧化能力與其化學(xué)成分的偏相關(guān)Table 1 Pearson correlation between antioxidant activities and chemical contents of ferment solution

3 小結(jié)

綜上所述，火棘果在發(fā)酵過程中，經(jīng)酵母發(fā)酵作用，將大部分糖轉(zhuǎn)化為酒精；其中黃酮、多酚雖為醇溶，但因為火棘果酒發(fā)酵液酒精度并不是很高，并且因其易氧化，在發(fā)酵過程中其含量在發(fā)酵一天后緩慢下降，直至保持不變；通過蛋白質(zhì)和游離氨基酸的實驗結(jié)果，可知部分蛋白質(zhì)分解為游離氨基酸。另外，對其抗氧化性的研究，表明火棘果的發(fā)酵液具有很強的抗氧化作用，在整個發(fā)酵過程中對ABTS自由基的清除作用和TEAC值保持持續(xù)上升的趨勢。

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