糖及乙醇對(duì)木葡糖酸醋桿菌種子液活力的影響

康麗茹，鐘春燕，王錫彬，向 東，王志國(guó)*

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南椰國(guó)食品有限公司，海南 ?？?570311）

細(xì)菌纖維素與高等植物細(xì)胞中的纖維素相比，具有高結(jié)晶度、高純度、高持水力，高楊氏模量等特性，因此廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥材料、造紙、服裝等領(lǐng)域，因此得以廣泛研究[1-2]。就目前的研究來看，主要集中于如何高產(chǎn)纖維素，如通過誘變篩選高產(chǎn)菌株[3-4]、優(yōu)化培養(yǎng)基配方[5-7]、發(fā)酵工藝的優(yōu)化等[8-11]。高產(chǎn)纖維素的前提是種子液活力要高，而種子液的制備方式通常為靜置培養(yǎng)，但在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)靜置培養(yǎng)制備種子液時(shí)，傳代次數(shù)多了，種子液的活力就會(huì)下降。盡管糖源及乙醇對(duì)纖維素的產(chǎn)量影響已有不少報(bào)道[12-15]，但就這些物質(zhì)對(duì)種子液活力的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以木葡糖酸醋桿菌為研究對(duì)象，對(duì)種子傳代次數(shù)、糖源及乙醇對(duì)纖維素的產(chǎn)量進(jìn)行了研究，對(duì)提高纖維素產(chǎn)量具有重要的實(shí)際意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus），海南大學(xué)食品學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：2.0%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.27%Na2HPO4、0.115%檸檬酸、2.0%瓊脂，自然pH值，121℃、15min條件下滅菌。

種子培養(yǎng)基：糖源（1.0%葡萄糖、2.0%葡萄糖、2.0%蔗糖、4.0%蔗糖），0.3%Na2HPO4、0.3%（NH4）2SO4、0.1%檸檬酸、0.025%MgSO4，調(diào)節(jié)pH值至4.0，105℃消毒15min。研究乙醇的影響時(shí)，添加1%vol乙醇。

生產(chǎn)培養(yǎng)基：自然發(fā)酵椰子水、白砂糖4.0%、0.3%（NH4）2SO4、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4，用10%NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5，105℃、15min條件下消毒[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SHP-1500生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法

菌種活化：挑取斜面培養(yǎng)基上的木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）于50mL種子培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)4d。

靜置方式制備種子液：菌種活化液按5%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接于100mL種子培養(yǎng)液，30℃靜置培養(yǎng)4d后，按5%（v/v）轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)4d，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，對(duì)每次轉(zhuǎn)接所制備的種子液進(jìn)行活力評(píng)估。

振搖方式制備種子液：菌種活化液按5%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接于100mL種子培養(yǎng)液，30℃、120r/min培養(yǎng)4d，按5%（v/v）轉(zhuǎn)接至新鮮的種子培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)4d，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，對(duì)每次轉(zhuǎn)接所制備的種子液進(jìn)行活力評(píng)估。

1.3.2 糖源對(duì)Ga.xylinus種子液活力的影響

在種子培養(yǎng)液中分別加入1.0%葡萄糖、2.0%葡萄糖、2.0%蔗糖、4.0%蔗糖，分別考察靜置方式、振搖方式對(duì)種子培養(yǎng)液活力的影響。

1.3.3 乙醇對(duì)Ga.xylinus種子液活力的影響

在種子培養(yǎng)液中以2.0%葡萄糖為碳源，加入1%vol的乙醇，分別考察靜置方式、振搖方式對(duì)種子培養(yǎng)液活力的影響。

1.3.4 分析方法

種子液活力的評(píng)估：種子液按5%（v/v）的接種量接種于300mL生產(chǎn)培養(yǎng)液中，30℃靜置培養(yǎng)6d，得到細(xì)菌纖維素，置于80℃，0.1mol/L NaOH溶液中，保持2h，冷卻后用0.1mol/L HCl中和至pH值為7.0，用自來水充分洗滌，在80℃條件下干燥至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。

菌落計(jì)數(shù)：將種子液取1mL，加入9mL無菌0.85%生理鹽水，如此重復(fù)后，將稀釋10、100、1000倍的稀釋液涂布于固體平板上，涂布后，置于30℃靜置培養(yǎng)6d，平板菌落計(jì)數(shù)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜置方式制備Ga.xylinus 種子液

2.1.1 糖種類及濃度對(duì)Ga.xylinus種子液活力的影響

從圖1可以看出，靜置方式制備Ga.xylinus種子液，其活力隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增加而下降。

第1次轉(zhuǎn)接時(shí)，種子液活力差別不大（1%葡萄糖、2%葡萄糖、2%蔗糖、4%蔗糖的活力分別為4.1g/L、4.2g/L、4.2g/L、4.3g/L），但隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，差別逐漸顯現(xiàn)，轉(zhuǎn)接至第5次時(shí)，2%蔗糖的種子液活力為2.1g/L，分別比1%葡萄糖、2%葡萄糖、4%蔗糖少38%、57%、52%。

當(dāng)種子液中的糖源為2%的葡萄糖時(shí)，下降的趨勢(shì)較為平緩，至第5代時(shí)，活力為3.3g/L，比第1代種子液的活力（4.2g/L）下降了約24%；而糖源為2%蔗糖時(shí)，種子液活力下降十分明顯，至第5代時(shí)，活力為2.1g/L，比第1代種子液的活力（4.2g/L）下降了50%。

圖1 糖對(duì)靜置方式制備種子液的活力影響Fig.1 Effects of sugars in stationary culture on its viability

2.1.2 乙醇對(duì)Ga.xylinus種子液活力及生物量的影響

靜置培養(yǎng)時(shí)，2%葡萄糖的種子液在連續(xù)5次傳代過程中活力相對(duì)穩(wěn)定，但仍下降了24%（見圖1），因此添加1%vol的乙醇進(jìn)行研究。

從圖2可以看出，添加1%vol的乙醇，傳代次數(shù)增加，種子液活力仍下降。但在同代中，比單純葡萄糖種子培養(yǎng)基的活力高，即使轉(zhuǎn)接至第5次時(shí)，種子液活力（4.3g/L）也與僅含2%葡萄糖的種子液轉(zhuǎn)接第1次的活力（4.2g/L）相當(dāng)。

圖2 乙醇對(duì)靜置方式制備種子液的活力影響Fig.2 Effects of ethanol in stationary culture on its viability

對(duì)含有乙醇的種子液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖3。從圖3可看出，靜置連續(xù)培養(yǎng)的8d時(shí)間內(nèi)，含乙醇的種子液比不含乙醇對(duì)照組（CK）中的菌落數(shù)始終更多。可見乙醇能增加生物量，從而減緩種子液在傳代過程中的活力下降。

總的說來，以靜置方式制備Ga.xylinus種子液時(shí)，其合適的培養(yǎng)基為2%葡萄糖、1%vol乙醇、0.3% Na2HPO4、0.3%（NH4）2SO4、0.1%檸檬酸、0.025%MgSO4，調(diào)節(jié)pH至4.0。培養(yǎng)條件為30℃，4d。

2.2 振搖方式制備種子液

2.2.1 糖種類及濃度對(duì)Ga.xylinus種子液活力的影響

圖3 乙醇對(duì)靜置方式制備種子液的生物量影響Fig.3 Effects of ethanol in stock culture cultivated statically on its biomass

振搖方式制備種子液，種子液活力隨代數(shù)增加變化降低趨勢(shì)更為明顯（圖4）。從圖4可以看出，采用1%的葡萄糖培養(yǎng)基，至第3代時(shí)，種子液幾乎沒有活力，采用2%蔗糖，至第4代時(shí)，種子液活力也幾乎喪失。

這種活力喪失的原因是種子液中木葡糖酸醋桿菌的數(shù)量銳減，因?yàn)閷⒎N子液用顯微鏡觀察，幾乎看不見木葡糖酸醋桿菌細(xì)胞的存在。

圖4 糖源對(duì)振搖方式制備種子液的活力影響Fig.4 Effects of sugars in stock culture cultivated shaking on its viability

總體說來，種子培養(yǎng)基的糖源以2%的葡萄糖更為合適，其次為4%的蔗糖。

2.2.2 乙醇對(duì)Ga.xylinus種子液活力及生物量的影響

在2%的葡萄糖種子培養(yǎng)基中添加1%vol乙醇，采用振搖方式制備種子液，其活力隨傳代次數(shù)增加逐漸減?。▓D5），但在同一代中，添加乙醇，明顯增加了種子液活力，這是由于前面4d內(nèi)，含乙醇的振搖種子液中含有更多的木葡糖酸醋桿菌細(xì)胞（如第4d時(shí)，無乙醇中為1.6×105CFU/mL，而乙醇培養(yǎng)液中為2.0×105CFU/mL）。從圖6可以看出，如果增加每代培養(yǎng)的時(shí)間，可以預(yù)料，添加1%vol乙醇的種子液的活力在傳代過程中，可能下降更快。

從圖7可以看出，每代種子液培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至8d，無論是否添加乙醇，種子液活力在傳代過程中都持續(xù)下降，而且同代種子液的活力比較看，乙醇似乎具有負(fù)作用，即種子液活力相對(duì)更低。

圖5 乙醇對(duì)振搖方式制備種子液的活力影響Fig.5 Effects of ethanol in stock culture cultivated shaking on its viability

圖6 乙醇對(duì)振搖方式制備種子液的生物量影響Fig.6 Effects of ethanol in stock culture cultivated shaking on its biomass

圖7 乙醇對(duì)振搖方式制備種子液的活力影響Fig.7 Effects of ethanol in stock culture cultivated by shaking for 8d on its viability

造成這一現(xiàn)象的原因可能是乙醇具有增菌作用，正因如此，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗更快，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，微生物總數(shù)量反倒減少，從而導(dǎo)致種子液活力下降。從圖7可以看出，添加乙醇的種子液中，當(dāng)傳代至第4代時(shí)，此時(shí)的種子液幾乎不能產(chǎn)生纖維素。

3 結(jié)論

Ga.xylinus種子液代數(shù)增加，無論是靜置方式還是振搖方式制備時(shí)，種子液活力隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增加而下降，但這種下降的趨勢(shì)因糖的種類不同而異，以2%葡萄糖為糖源時(shí)，下降趨勢(shì)更緩，如果添加1%vol的乙醇，因?yàn)橐掖加性鼍饔?，下降趨?shì)得到緩解。但在振搖制備時(shí)，盡管添加乙醇也能緩解種子液活力的下降，但培養(yǎng)的時(shí)間不宜超過4d。

靜置培養(yǎng)制備Ga.xylinus種子液時(shí)，以2%葡萄糖結(jié)合1%vol乙醇為較佳，但傳代次數(shù)宜控制，結(jié)合先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[18]，還要注意裝液量不能太大，否則易出現(xiàn)衰退菌株。

[1]POKALWAR S U,MISHRAL M K,MANWAR A V.Production of cellulose byGluconacetobactersp.[J].Recent Res Sci Tech,2010,2(7):14-19.

[2]CHAWLA P R,BAJAJ I B,SURVASE S A,et al.Microbial cellulose:fermentative production and applications[J].Food Technol Biotech,2009,47(2):107-124.

[3]毋銳琴.高產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2008.

[4]葛含靜.細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株高壓誘變選育及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士論文，2012.

[5]李兆乾，裴重華，彭碧輝.細(xì)菌纖維素的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2007，15（2）：64-67.

[6]謝健健，洪 楓.細(xì)菌纖維素發(fā)酵原料的研究進(jìn)展[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2011，19（3）：68-77.

[7]張繼東.木醋桿菌發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究[D].南京理工大學(xué)博士論文，2004.

[8]趙 瓊，楊 謙.木醋桿菌突變株產(chǎn)細(xì)菌纖維素發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（6）：44-48.

[9]秦微微，遲玉杰.木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵方式的探討[J].中國(guó)釀造，2006，25（6）：33-36.

[10]SANI A,DAHMAN Y.Improvements in the production of bacterial synthesized biocellulose nanofibres using different culture methods[J].J Chem Technol Biot,2010,85(2):151-164.

[11]JUNG J Y,KHAN T,PARK J K,et al.Production of bacterial cellulose byGluconacetobacter hanseniiusing a novel bioreactor equipped with a spin filter[J].Korean J Chem Eng,2007,24(2):265-271.

[12]王志國(guó)，王錫彬，向 東，等.乙醇在合成培養(yǎng)基中對(duì)木醋桿菌HN001合成纖維素的影響[J].食品科技，2007（12）：47-49.

[13]馬 霞，王瑞明，關(guān)鳳梅，等.非碳水化合物對(duì)木醋桿菌合成細(xì)菌纖維素影響規(guī)律的初探[J].中國(guó)釀造，2003，22（4）：15-17.

[14]張鳳清，張海悅，鄭春雨，等.玉米漿做Acetobacter xylinum培養(yǎng)基生產(chǎn)纖維素的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2005，26（2）：107-108.

[15]羅錦洪，盧紅梅，張義明，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國(guó)釀造，2008，27（22）：39-41.

[16]王志國(guó)，鐘春燕，王錫彬，等.椰子水自然發(fā)酵條件對(duì)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的影響[J].中國(guó)釀造，2009，28（4）：32-34.

[17]葉 明.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].安微：合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2009.

[18]吳 謙，謝必祺，劉耀謙，等.木葡糖醋桿菌靜置培養(yǎng)中的衰退現(xiàn)象初探[J].中國(guó)釀造，2013，32（5）：19-21.