川西高原冰酒發(fā)酵中Pichia anomala的鑒定與耐受性研究

許青蓮，邢亞閣*，車振明，李 可，張麗珠，羅建峰，盧 靖

（1.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院 食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川 阿壩藏族羌族自治州 623104）

冰葡萄酒是在-7℃的氣溫條件下，將葡萄掛在枝頭上并通過低溫自然冷凍和風(fēng)干，使果實(shí)中的糖度及其他內(nèi)容物得到高濃度濃縮，然后在低溫結(jié)冰的狀態(tài)下采摘，立即進(jìn)行壓榨、低溫保糖發(fā)酵釀造而成的葡萄酒。釀造冰酒的葡萄酒品種有威達(dá)爾（Vidal）、雷司令（Riesling）、長相思（Sauvigon Blance）、貴人香（I-talian Riesling）等[1]。近年來，川西高原藏區(qū)阿壩州理縣以其特殊的氣候條件，開發(fā)研制了威代爾等系列冰葡萄酒，不僅酒體口感好，味道獨(dú)特，而且很受當(dāng)?shù)厝说南矚g。在冰葡萄酒生產(chǎn)中，由于影響葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素是其中的發(fā)酵微生物，而酵母菌作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量和發(fā)酵生產(chǎn)管理影響很大，而且對葡萄酒特色和風(fēng)格的形成也至關(guān)重要[2]。真正優(yōu)良的葡萄酒酵母，應(yīng)該具備起酵快，能耐乙醇、高SO2、低溫等優(yōu)點(diǎn)[2-4]。

利用基因測序通過對威代爾冰葡萄汁發(fā)酵過程中的主要酵母菌之一的異常畢赤酵母（Pichia anomala）菌株進(jìn)行了分離鑒定，并進(jìn)一步研究了Pichia anomala菌株的耐溫性能、耐酸堿性能、耐乙醇、SO2和糖等性能，為川西藏區(qū)冰葡萄酒擴(kuò)大生產(chǎn)提供了一定的技術(shù)支持，對川西高原冰葡萄酒行業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

冰葡萄發(fā)酵汁，由四川阿壩州理縣塔斯酒莊提供；乙醇、亞硫酸、甘油、氯化鎂等化學(xué)試劑均由成都科龍化工廠提供；酵母菌18S rDNA PCR和電泳檢測試劑，膠回收和連接試劑，酶切試劑等由成都東盛公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)液、培養(yǎng)基的制備[4-7]

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extractpeptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)液：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2.0%。

虎紅瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，葡萄糖1.0%，瓊脂2.0%，0.1%孟加拉紅溶液：0.33%，氯霉素：0.01%。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器公司；SHA-B型恒溫振蕩箱：金壇市富華儀器有限公司；pHS-25精密pH計(jì)：上海精科雷磁儀器廠；721分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DYY-8C型雙定時(shí)電泳儀：鄭州朋來儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

從酒莊運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室的威代爾冰葡萄進(jìn)行榨汁處理，用虎紅培養(yǎng)基從葡萄汁中篩選出生長旺盛且特征明顯的1株菌，通過平板劃線分離出該株菌的單菌落，挑取單菌落在液體PDA培養(yǎng)液中培養(yǎng)后用甘油保存菌株，放置在-20℃?zhèn)溆肹4，8-10]。

1.3.2 菌株分子鑒定

采用18S rDNA序列分析法對分離出的菌種進(jìn)行分子鑒定。采用玻璃珠法[1]提取基因組總DNA：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系：30μL重蒸水（ddH2O），5μL 10×PCR 擴(kuò)增緩沖液（Reaction Buffer）（Mg2+Free），6μL MgCl2（25mmol/L），4μL 三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）（2.5mmol/L），引物NSl（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）和NS8（5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’）各1μL，1μL Taq聚合酶（2.5U/μL），2μL總DNA模板，PCR程序[4，11-13]簡述如下：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后最終72℃保持10min，然后電泳和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色檢測目標(biāo)產(chǎn)物有無及效果。并按照pGEM-T Easy Vector System I（Promega USA）說明將PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，涂布于含氨芐青霉素（Amp，100μg/mL）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，24μg/mL）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal，40μg/mL）的LB平板上，篩選陽性克隆子。挑取陽性克隆子，按照Plasmid Mini Kit I（OMEGA USA）說明提取重組質(zhì)粒，應(yīng)用酶切法鑒定插入片段是否正確。酶切反應(yīng)條件[9，14]：重組質(zhì)粒2μL，EcoRI（Fermentas）1μL，10×EcoRI Buffer 1μL，重蒸水（ddH2O）6μL。經(jīng)E.coli RI酶切檢測后含有完整16S rRNA的重組質(zhì)粒采用Applied Piosystems DNASequencer（model 377）自動測序。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫NCBI Blast比對后，再通過Clustal X1.8將代表序列與數(shù)據(jù)庫中所得序列進(jìn)行完全比對，測得序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得序列號。

1.3.3 耐受性實(shí)驗(yàn)

耐溫性分析：將實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)ichia anomala活化后接種于帶有杜氏管的YPD培養(yǎng)基中，接種量為1.0×107CFU/mL，然后分別放于8℃、20℃、28℃、32℃和36℃條件下培養(yǎng)24h，在波長600nm條件下測其吸光度值。耐pH值、耐二氧化硫和耐糖性能分析[15]：分別采用不同的pH值（1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0）、乙醇濃度（4%vol、8%vol、12%vol、16%vol）、二氧化硫（采用亞硫酸鈉進(jìn)行二氧化硫濃度調(diào)節(jié)，二氧化硫濃度采用碘吸收滴定法進(jìn)行測定[16]）含量（100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L）、及蔗糖含量（15%、25%、40%、55%、70%）的帶有杜氏管的YPD培養(yǎng)基中，接種量為1.0×107CFU/mL，25℃培養(yǎng)24h，在波長600nm處測其吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pichia anomala 酵母菌的分離鑒定

標(biāo)準(zhǔn)品基因和目的基因擴(kuò)增電泳結(jié)果分別如圖1和圖2。由圖1和圖2電泳亮斑可知，對樣本的18S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增片段的大小約為1.8kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達(dá)到了對酵母的18S rDNA基因的PCR擴(kuò)增目的。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品基因Fig.1 Standard gene

圖2 目的基因擴(kuò)增電泳圖瓊脂糖(1%)Fig.2 PCR electrophoretogram of objective gene (agarose 1%)

經(jīng)TaqDNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)A。正是基于這一原理，pGEM質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ切成平端后，在開口端加上一個(gè)T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于T-A互補(bǔ)，從而提高了T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。由于T-A克隆只需要純化PCR產(chǎn)物，因而操作較為簡便。pGEM-T載體含絲狀噬菌體f1的復(fù)制起始區(qū)，用于產(chǎn)生環(huán)狀ssDNA；含有T7和SP6 RNA聚合酶啟動子；在多克隆區(qū)域具有編碼β-半乳糖苷酶的基因（LacZ），插入失活α-肽可在指示平板上通過藍(lán)、白菌落直接篩選重組菌落。

在實(shí)驗(yàn)中采用了內(nèi)切酶EcoRⅠ對重組后的質(zhì)粒進(jìn)行了切割，因此嵌合有18S rRNA/DNA目的基因的重組質(zhì)粒pGEM-T的酶切片段電泳亮斑應(yīng)和DNA MarkerⅦ中長度為2.0kb和1.5kb的核酸片段亮斑位置相近。如圖3，連接反應(yīng)成功的將PCR擴(kuò)增后的18S rDNA基因連接到了T-載體上，并在感受態(tài)的大腸桿菌中得到了表達(dá)，形成白色菌落，通過電泳檢測到完整的18S rDNA基因，通過基因測序，鑒定出為異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）。

圖3 質(zhì)粒酶切瓊脂糖（1%）Fig.3 Plasmid enzyme digestion（agarose 1%）

2.2 耐溫性分析

在四川高原藏區(qū)，冰葡萄酒的發(fā)酵溫度一般控制在10℃左右，這樣使得冰葡萄酒原料能夠在一定的低溫條件進(jìn)行緩慢長時(shí)間發(fā)酵，以期獲得較好的冰葡萄酒品質(zhì)。將分離純化得到的異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）接種于培養(yǎng)基后在不同溫度下觀察其生長情況，結(jié)果表明（圖4），隨著溫度的增加，該酵母菌株的生長情況明顯好轉(zhuǎn)，然而當(dāng)溫度超過28℃后，其生長力有所下降。由圖4可知，該酵母菌株在低溫條件下如8℃時(shí)，具有一定的生長力。結(jié)果表明，該酵母菌株可以滿足冰葡萄酒的生產(chǎn)所需。

圖4 不同溫度對Pichia anomala酵母菌活性的影響Fig.4 Effect of different temperature on the activity ofPichia anomala

2.3 耐酸堿性能分析

酵母菌的耐酸堿性能對于葡萄酒的發(fā)酵過程影響比較大，因此，本實(shí)驗(yàn)將異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）接種于pH值分別為1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明（圖5），該酵母菌株隨著pH值的增加，其活菌數(shù)出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在pH=6.0處，生長得最好，在pH=4.0處，生長情況也比較好。在pH值為4.0和6.0時(shí)，其生長情況明顯好于在其他pH值的環(huán)境中。

圖5 不同pH值對Pichia anomala酵母菌活性的影響Fig.5 Effect of different pH values on the activity ofPichia anomala

2.4 耐乙醇性能分析

在冰葡萄酒釀造中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄醪中的酒精度會有一定的變化，發(fā)酵前期會有上升的趨勢。因此，在冰葡萄酒釀造過程中，對酵母菌株耐乙醇性能的研究具有一定的意義。由圖6可知，當(dāng)乙醇濃度為4%vol時(shí)，該菌株的生長情況較好，而當(dāng)濃度增加8%vol時(shí)，該酵母菌的生長變得緩慢，當(dāng)乙醇濃度進(jìn)一步增加，該酵母菌的存活量明顯低于其在低乙醇濃度環(huán)境下。結(jié)果表明，該酵母菌對乙醇具有一定的耐受性。

圖6 不同乙醇濃度對Pichia anomala酵母菌活性的影響Fig.6 Effect of different ethanol concentrations on the activity ofPichia anomala

2.5 耐SO2性能分析

在冰葡萄酒或其他類型的葡萄酒釀造中，通常在葡萄醪中添加一定亞硫酸，轉(zhuǎn)化為二氧化硫，從而起殺菌、澄清、增酸等作用。因此，在冰葡萄酒釀造過程中，對酵母菌株的耐二氧化硫能力的研究就顯得必要。由圖7可以看出，采用亞硫酸鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中SO2濃度，當(dāng)SO2含量為100mg/L時(shí)，該菌株的生長情況較好，而當(dāng)濃度增加200mg/L時(shí)，該酵母菌的生長明顯得到抑制。隨著SO2（亞硫酸鈉）濃度的增加，該酵母菌的存活量逐漸下降，結(jié)果表明，該酵母菌對SO2具有一定的耐受性。

圖7 不同SO2濃度對Pichia anomala酵母菌活性的影響Fig.7 Effect of different SO2 concentrations on the activity ofPichia anomala

2.6 耐糖性能分析

對于冰葡萄酒而言，在發(fā)酵初期，發(fā)酵液中的含糖量是比較高的，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，殘?zhí)堑南陆邓俣纫脖容^快，酵母菌應(yīng)具有一定的耐糖性能，才能使冰葡萄酒的發(fā)酵順利進(jìn)行。由圖8可知，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為15%時(shí)，該菌株的生長情況較好，而當(dāng)質(zhì)量濃度增加為25%時(shí)，該酵母菌的生長有所減緩。隨著糖質(zhì)量濃度的增加，該酵母菌的存活量逐漸下降，而當(dāng)糖的質(zhì)量濃度增加至40%時(shí)，該酵母菌的生長明顯得到抑制。結(jié)果表明，該酵母菌具有較好的耐糖性能。

圖8 不同蔗糖質(zhì)量濃度對Pichia anomala酵母菌活性的影響Fig.8 Effect of different sucrose contents on the activity ofPichia anomala

3 結(jié)論

本研究從四川藏區(qū)高原威代爾冰葡萄果實(shí)中分離純化出了異常畢赤酵母菌（Pichia anomala）菌株，采用18S rDNA D1/D2序列進(jìn)行了基因鑒定，并通過耐性實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示鑒定出的異常畢赤酵母分別在28℃、pH=4.0或6.0條件下，生長情況較好，在低溫8℃條件下具有一定的生存力。并對乙醇、二氧化硫和糖均有一定的耐受性。此研究對篩選川西冰葡萄酒產(chǎn)區(qū)特色酵母菌，構(gòu)建冰葡萄酒發(fā)酵微生物資源庫和豐富其種質(zhì)資源具有重要意義。但是，由于形成冰葡萄酒特有風(fēng)味品質(zhì)的發(fā)酵微生物菌群十分復(fù)雜，我們的研究也仍將繼續(xù)，以期為川西藏區(qū)冰葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

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