激活乙醛脫氫酶2抑制老年大鼠心肌缺血再灌注損傷

邢 媛, 殷 玥, 石曌玲, 李 晨, 王博文, 王衍帥, 高 峰, 馬 恒

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激活乙醛脫氫酶2抑制老年大鼠心肌缺血再灌注損傷

邢 媛1, 殷 玥1, 石曌玲2, 李 晨3, 王博文3, 王衍帥3, 高 峰1, 馬 恒1

（第四軍醫(yī)大學(xué):1生理學(xué)教研室;2西京醫(yī)院兒科;3口腔醫(yī)學(xué)系, 西安 710032）

衰老心肌對(duì)缺血/再灌注（I/R）損傷的耐受能力顯著降低，導(dǎo)致老年心肌缺血易損性。本研究旨在探討乙醛脫氫酶2（ALDH2）激動(dòng)劑Alda-1對(duì)老年大鼠心肌I/R損傷的影響。成年（3～4月齡，40只）和老年（22～24月齡，40只）雄性SD大鼠隨機(jī)分為I/R組和I/R+Alda-1治療組。采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎缺血30min再灌注4h建立在體大鼠急性心肌I/R模型，于再灌注前5min經(jīng)靜脈分別以2ml/（kg·h）速度分別輸注生理鹽水（0.9% NaCl）和Alda-1（16mg/kg）并持續(xù)到再灌注結(jié)束。于術(shù)中監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，再灌注結(jié)束后取心肌組織檢測(cè)ALDH2活性、蛋白質(zhì)羰基化程度和心肌內(nèi)活性氧簇（ROS）水平，抽取血樣檢測(cè)LDH水平。檢測(cè)心肌ALDH2活性顯示，老年心肌ALDH2活性較成年組顯著降低。與成年組相比，老年心肌缺血再灌注損傷顯著加重，表現(xiàn)為心肌收縮舒張速率顯著降低，血清乳酸脫氫酶（LDH）水平顯著增加（均＜0.05）。再灌注期Alda-1治療可有效提高老年I/R心肌ALDH2活性（＜0.05），并顯著抑制老年大鼠的上述心肌缺血再灌注損傷（均＜0.05）。老年組I/R心肌中蛋白質(zhì)羰基化程度和ROS生成較成年I/R心肌顯著增加（均＜0.05）。Alda-1治療可有效改善老年I/R心肌中的蛋白質(zhì)羰基化和ROS水平。激活心肌ALDH2可顯著改善衰老心肌抗I/R損傷能力，其機(jī)制可能與減輕I/R導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化損傷有關(guān)。

乙醛脫氫酶2; 衰老; 缺血再灌注損傷; 蛋白質(zhì)羰基化; 活性氧簇

大量的流行病學(xué)資料顯示，隨著患者年齡的增加，心血管系統(tǒng)對(duì)缺血損傷的耐受能力顯著降低，表現(xiàn)為心肌易損性增加[1]。這是導(dǎo)致老年人群缺血性心臟病高發(fā)病率和高死亡率的重要原因[2]。但是，老年性心肌缺血易損狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。

在缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）過程中，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多種內(nèi)源性的具有很強(qiáng)生物反應(yīng)活性的不飽和醛類化合物[3]，其結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)變性形成羰基化改變，破壞心肌蛋白活性[4]。正常生理?xiàng)l件下，內(nèi)源性生成的醛類物質(zhì)的產(chǎn)生和清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，并在體內(nèi)履行一定的生理功能[5]。但是在衰老過程中已經(jīng)觀察到體內(nèi)的醛毒清除能力逐漸減弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等生物大分子的羰基化失活增加。乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydro- genase 2，ALDH2）催化細(xì)胞內(nèi)醛類氧化為羧基酸是體內(nèi)最徹底的羰基轉(zhuǎn)化機(jī)制[6]。近來的研究顯示，激活A(yù)LDH2可抑制心肌缺血再灌注損傷[7,8]。我們前期研究顯示，心肌中ALDH2可清除缺血再灌注心肌內(nèi)的4-HNE等醛類物質(zhì)毒性，保護(hù)心肌細(xì)胞功能。但是，衰老心肌中ALDH2的表達(dá)水平與老年心肌缺血易損狀態(tài)的聯(lián)系尚不清楚。本研究旨在觀察新近發(fā)現(xiàn)的小分子激動(dòng)劑Alda-1激活心肌ALDH2對(duì)老年大鼠缺血再灌注心肌損傷的影響，比較分析ALDH2對(duì)衰老心肌發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制，為更加全面地認(rèn)識(shí)ALDH2心肌保護(hù)機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

成年（3～4月齡）和老年（20～22月齡）雄性SD（Sprague Dawley）大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DU640紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)于南京建成生物制品研究所。微量注射泵為美國(guó)Harvard公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

成年和老年SD大鼠進(jìn)行開胸、冠狀動(dòng)脈左室支掛線以及經(jīng)靜脈輸液等操作。采用左前降支結(jié)扎缺血30min再灌注4h建立在體大鼠急性心肌I/R模型，于再灌注前5min經(jīng)靜脈以程控微量注藥泵輸液給藥，分別以2ml/（kg·h）速度輸注生理鹽水（0.9% NaCl）；和Alda-1（16mg/kg）并持續(xù)到再灌注結(jié)束。再灌注開始后，封閉胸腔，恢復(fù)動(dòng)物自主呼吸。將微導(dǎo)管自右側(cè)頸動(dòng)脈插管至左心室，記錄左室內(nèi)壓。左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）及其變化微分（±LVdp/dtmax）均通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)采集并計(jì)算。于再灌注結(jié)束后取血用分光光度法檢測(cè)LDH活性。

1.3 ALDH2活性測(cè)定

比色法定量檢測(cè)心肌ALDH2活性水平。ALDH2的酶活性是根據(jù)在NAD+轉(zhuǎn)化為NADH+的過程中應(yīng)用紫外分光光度儀檢測(cè)340nm的吸光度值而定。NADH在340nm處的毫摩爾消光系數(shù)為6.22。ALDH2的活性表示為NADH/（min·mg protein）。

1.4 HNE含量檢測(cè)

采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定細(xì)胞及組織中4-HNE水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell BioLabs （OxiSelect? HNE-His Adduct ELISA Kit）。

1.5 蛋白質(zhì)羰基化檢測(cè)

心肌蛋白樣品懸浮于10mmol/L的2，4-二硝基苯肼，室溫孵育30min，加入20%三氯酸，離心后懸浮于6mol/L的胍溶液。于360～390nm檢測(cè)光吸收羰基含量計(jì)算公式：在360nm處的吸收×45.45nmol/蛋白質(zhì)含量（mg）。

1.6 心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的檢測(cè)

用ROS敏感的熒光探針（CM-H2DCFDA）標(biāo)記心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2DCFDA熒光強(qiáng)度變化，以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactiveoxygen species，ROS）含量的變化。ROS陽性細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被染成紅色。拍照后用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（Media-Cybernetics Inc）計(jì)算平均吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way Analysis Ovariance，One-Way ANOVA），若總體差異顯著, 再以SNK-q檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間顯著性差異。以＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌ALDH2酶活性

在基礎(chǔ)狀態(tài)下，與成年心肌相比，老年組心肌中的ALDH2活性顯著降低（＜0.05）。在生理鹽水對(duì)照組，I/R可抑制成年及老年心肌中的ALDH2活性，但是老年組的ALDH2活性程度降至更低。與鹽水對(duì)照組相比，再灌注過程中給予Alda-1治療可顯著激活成年及老年心肌ALDH2的活性（均＜0.05；圖1）。

2.2 Alda-1治療對(duì)成年及老年I/R心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響

缺血前各組間血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血后室內(nèi)壓及其微分均出現(xiàn)降低，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注期間予不同輸液處理，各組間心率差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，采用心率壓力指數(shù)及室內(nèi)壓微分±LVdP/dtmax衡量心臟功能發(fā)現(xiàn)，在鹽水對(duì)照組，與成年組相比，老年心肌再灌注4h后心率壓力指數(shù)及±LVdP/dtmax均顯著降低（均＜0.05），表明老年心肌缺血再灌注損傷顯著加重。治療組的結(jié)果提示，Alda-1治療可有效提高成年及老年組心肌缺血再灌注后心臟功能指標(biāo)，心率壓力指數(shù)及±LVdP/dtmax較鹽水對(duì)照組均得到顯著改善（均＜0.05）。并且，對(duì)比缺血再灌注后心臟功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，成年Alda-1治療組與老年Alda-1治療組相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示，Alda-1治療可有效提高老年心肌的抗缺血損傷能力，促進(jìn)老年心肌缺血再灌注后心臟功能恢復(fù)（圖2）。

2.3 Alda-1治療對(duì)血清LDH的的影響

采用分光光度法檢測(cè)心肌I/R后外周靜脈血清LDH活性。如圖3所示，在鹽水對(duì)照組，與成年組相比，老年心肌再灌注4h后血清LDH水平顯著增加（＜0.05），表明老年心肌缺血再灌注損傷顯著加重。與鹽水對(duì)照組相比，Alda-1治療有效降低成年及老年組心肌缺血再灌注后血清LDH水平（均＜0.05）。成年Alda-1治療組與老年Alda-1治療組相比并無明顯差異（圖3）。

2.4 Alda-1治療對(duì)蛋白質(zhì)羰基化程度的影響

心肌I/R后提取心肌蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)羰基化程度。結(jié)果顯示，鹽水對(duì)照組中，老年心肌再灌注4h后蛋白質(zhì)羰基化水平與成年組相比顯著增加（＜0.05），表明老年心肌中缺血再灌注導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損傷程度顯著加重。與鹽水對(duì)照組相比，Alda-1治療有效降低成年及老年組心肌缺血再灌注后蛋白質(zhì)羰基化水平（均＜0.05）。成年Alda-1治療組與老年Alda-1治療組相比并無明顯差異（圖4）。

圖1 Alda-1治療對(duì)成年及老年缺血再灌注心肌ALDH2酶活性的影響

Figure 1 Effect of Alda-1 treatment on activity of ALDH2 in adult and aged ischemia/reperfusion myocardium (=8)

與成年對(duì)照組比較,*<0.05; 與成年缺血再灌注組比較,#<0.05; 與老年對(duì)照組比較,△<0.05; 與老年缺血再灌注組比較,▲<0.05

圖2 Alda-1治療對(duì)成年及老年I/R心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響

Figure 2 Effect of Alda-1 treatment on hemodynamics of adult and aged ischemia/reperfusion myocardium (＝10)

A: 心率壓力指數(shù); B, C: 室內(nèi)壓微分。與成年生理鹽水組比較,*＜0.05; 與老年生理鹽水組比較,#＜0.05

圖3 Alda-1治療對(duì)成年及老年缺血再灌注大鼠血清LDH的影響

Figure 3 Effect of Alda-1 treatment on serum level of LDH2 in adult and aged rats (＝10)

與成年生理鹽水組比較,*＜0.05; 與老年生理鹽水組比較,#＜0.05

2.5 Alda-1治療對(duì)心肌ROS的影響

心肌I/R后提取心肌蛋白檢測(cè)心肌中ROS含量后發(fā)現(xiàn)，鹽水對(duì)照組中，老年心肌再灌注4h后ROS水平與成年組相比顯著增加（＜0.05），表明老年心肌中I/R導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷程度顯著加重。與鹽水對(duì)照組相比，Alda-1治療有效降低成年及老年組心肌缺血再灌注后心肌ROS水平（均＜0.05）。成年Alda-1治療組與老年Alda-1治療組相比并無明顯差異（圖5）。

圖4 Alda-1治療對(duì)成年及老年缺血再灌注大鼠心肌蛋白質(zhì)羰基化的影響

Figure 4 Effect of Alda-1 treatment on protein carbonyl of ALDH2 in adult and aged ischemia/reperfusion myocardium (＝10)

與成年生理鹽水組比較,*＜0.05; 與老年生理鹽水組比較,#＜0.05

圖5 Alda-1治療對(duì)成年及老年缺血再灌注大鼠心肌ROS水平的影響

Figure 5 Effect of Alda-1 treatment on level of ROS in adult and aged ischemia/reperfusion myocardium (＝10)

與成年生理鹽水組比較,＜0.05; 與老年生理鹽水組比較,#＜0.05

3 討 論

我國(guó)正面臨人口老齡化的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)多重心血管病危險(xiǎn)綜合防治建議中指出，人口老齡化已經(jīng)成為我國(guó)人群心血管病發(fā)病率和死亡率逐年上升的重要原因[9]。衰老導(dǎo)致心肌出現(xiàn)易損狀態(tài)，顯著降低心臟抵抗I/R損傷的耐受力。大量的流行病學(xué)資料顯示，隨著患者年齡的增加，心血管系統(tǒng)對(duì)缺血損傷的耐受能力顯著降低，表現(xiàn)為心肌易損性增加[1]。這是導(dǎo)致老年人群缺血性心臟病高發(fā)病率和高死亡率的重要原因[2]。臨床資料顯示，70歲以上急性心肌缺血患者出現(xiàn)明顯的預(yù)后不良，如較低的射血分?jǐn)?shù)，更多的并發(fā)癥等，并且老年患者心肌缺血死亡率較年輕患者顯著增加[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)，心肌缺血耐受性的損失，始于中年（12個(gè)月）出現(xiàn)，隨衰老而日益惡化（18個(gè)月和24～28個(gè)月）[11]。雖然臨床和實(shí)驗(yàn)室觀察均顯示，衰老降低了心臟抵抗I/R損傷的耐受力，但是老年性心肌易損狀態(tài)的原因尚不清楚。本研究明確證實(shí)，老年心肌I/R損傷與成年組相比顯著加重，表現(xiàn)為心肌收縮舒張速率顯著降低，血清LDH水平顯著增加。因此，深入探討老年性心肌缺血易損性的發(fā)病機(jī)制及其防治措施意義重大。

心肌具有高氧耗、低儲(chǔ)能的特性；同時(shí)，自身的抗氧化能力相對(duì)較弱。近年來，內(nèi)源性代謝產(chǎn)生的高反應(yīng)性醛在心血管系統(tǒng)損傷的細(xì)胞毒性過程中的作用開始引起關(guān)注。體內(nèi)脂肪酸過氧化會(huì)產(chǎn)生多種內(nèi)源性的、具有很強(qiáng)生物反應(yīng)活性的不飽和醛類化合物。例如：4-羥基-2-壬烯醛（4-HNE）、丙二醛、丙烯醛等。由于醛類物質(zhì)的化學(xué)特性，極易發(fā)生親核基團(tuán)反應(yīng)，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)交聯(lián)變性形成羰基化加合物，破壞心肌激酶活性[12]。此外，越來越多的線索顯示，高反應(yīng)性醛具有細(xì)胞毒性并且與多種疾?。ㄌ貏e是退行性疾?。┫嚓P(guān)：高血糖誘導(dǎo)丙酮醛參與糖尿病性細(xì)胞損傷[13]；4-HNE 參與I/R心肌損傷，4-HNE 還導(dǎo)致關(guān)鍵激酶失活；4-HNE 直接作用抑制心肌細(xì)胞收縮舒張能力，破壞線粒體活性[8]；丙烯醛顯著增加心肌易損性[14]。內(nèi)源性醛類物質(zhì)的心肌毒性日漸明確。并且，毒性醛能穿過膜結(jié)構(gòu)到達(dá)全身，而具有共軛結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物能夠穩(wěn)定地留在細(xì)胞內(nèi)[15]。但是，有針對(duì)性地改善醛毒性積累導(dǎo)致的蛋白質(zhì)羰基化損傷是否可以增加老年心肌抗缺血能力仍屬未知。正常生理?xiàng)l件下，內(nèi)源性生成的不飽和醛類物質(zhì)的產(chǎn)生和清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程[5]。一旦醛毒的產(chǎn)生和清除的平衡被打破，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)等生物大分子的羰基化失活增加，在遭受缺血再灌注等有害損傷下，將導(dǎo)致?lián)p傷加重。而線粒體ALDH2是細(xì)胞內(nèi)將毒性醛氧化為羧基酸的最重要催化機(jī)制[16]。ALDH2廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級(jí)或二級(jí)醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)。我們對(duì)ALDH2的前期研究顯示，在心肌細(xì)胞中ALDH2可以迅速清除細(xì)胞內(nèi)的HNE等醛類物質(zhì)毒性，保護(hù)心肌細(xì)胞功能[8]。但是，激活A(yù)LDH2抑制蛋白質(zhì)羰基化損傷能否保護(hù)老年心肌功能、抑制衰老心肌缺血易損性，尚需深入研究。

針對(duì)上述問題，本研究首次發(fā)現(xiàn)，再灌注期間激活心肌ALDH2可有效改善老年心肌I/R后收縮舒張功能恢復(fù)，減小心肌損傷。因此，激活心肌ALDH2可顯著改善衰老心肌抗I/R損傷能力。并且，本研究在心肌I/R后提取心肌蛋白定量觀察了激活心肌ALDH2對(duì)老年心肌蛋白質(zhì)羰基化和氧化應(yīng)激的影響，發(fā)現(xiàn)激活心肌ALDH2可有效抑制老年心肌中蛋白質(zhì)羰基化水平和氧化應(yīng)激程度，這可能是ALDH2改善衰老心肌抗I/R損傷能力的機(jī)制之一。上述發(fā)現(xiàn)提示，ALDH2可能是抑制老年性心肌損傷的干預(yù)新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究顯示，衰老導(dǎo)致心肌I/R損傷顯著加重，激活心肌ALDH2可顯著改善衰老心肌抗I/R損傷能力，進(jìn)而促進(jìn)老年心臟再灌注后功能的恢復(fù)。該作用可能與ALDH2清除老年心肌中的醛毒性、有效抑制老年心肌中蛋白質(zhì)羰基化損傷和氧化應(yīng)激程度有關(guān)。本研究有助于闡明ALDH2在心肌衰老中的關(guān)鍵基礎(chǔ)機(jī)制并豐富衰老與心肌缺血易損性的內(nèi)在分子聯(lián)系。

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（編輯: 王雪萍）

Acetaldehyde dehydrogenase 2 activation inhibits myocardial ischemia-reperfusion injury in senescent rats

XING Yuan1, YIN Yue1, SHI Zhao-Ling2, LI Chen3, WANG Bo-Wen3, WANG Yan-Shuai3, GAO Feng1, MA Heng1

(1Department of Physiology,2Department of Pediatrics, Xijing Hospital,3School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi￠an 710032, China)

Aging heart shows significantly reduced tolerance to myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury, so senescent heart is prone to be damaged by the injury. This study was designed to investigate the protective effect of acetaldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) agonist Alda-1 in aging rats after myocardial I/R injury.A total of 40 aging male Sprague Dawley (SD) rats (at an age of 20 to 22 months) were randomized into I/R group (I/R) and Alda-1 group (I/R＋Alda). Another 40 adult rats at an age of 3 to 4 months served as adult control. Rat acute myocardial I/R model was established by ligation of left anterior descending artery for 30min followed by reperfusion for 4h. Alda-1(16mg/kg) and normal saline at the same volume were intravenously infused at a flow rate of 2ml/(kg·h) into the left ventricle of corresponding rats in 5min before reperfusion. The left ventricular pressure was monitored at the same time. At the end of 4 hours reperfusion, ALDH2 activity, reactive oxygen species (ROS) production, and protein carbonylation in the myocardial tissue were measured. Serum level of lactate dehydrogenase (LDH) was tested.A significant decrease in ALDH2 activity was observed in the aging hearts, but this effect was blocked by Alda-1. Compared with the adult hearts, myocardial I/R injury was significantly aggravated in aging hearts, which were evidenced by reduced±LVdP/dtmaxand increased serum level of LDH (＜0.05). ALDH2 activator infusion during reperfusion effectively suppressed the above mentioned ischemic injury in the aging hearts (＜0.05). Furthermore, protein carbonylation and ROS production in the myocardium were increased in the aging hearts compared with the adult hearts (＜0.05), which was attenuated by Alda-1 treatment.Activating myocardial ALDH2 significantly improves the resistance ability to myocardial I/R injury in aging heart. ALDH2-induced cardiac protection may be through suppressing myocardial I/R-induced protein oxidative damage.

ALDH2; aging; myocardial ischemia/reperfusion; protein carbonyl; reactive oxygen species

(No.81170108).

R331.3; R592

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00096

2012-10-29;

2012-11-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81170108）

馬 恒, Tel: 029-84779210, E-mail: hengma@fmmu.edu.cn