腫瘤干細(xì)胞(CSCs)放療抵抗機(jī)制的研究進(jìn)展

燕 麗(綜述) 喬田奎 范 衛(wèi)(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科 上海 200540)

隨著腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)這一概念的提出，越來越多的研究探討CSCs在腫瘤治療中作用，已有研究發(fā)現(xiàn)CSCs是腫瘤治療后復(fù)發(fā)的根源，根治腫瘤首先應(yīng)該根除CSCs[1］。手術(shù)是治療腫瘤的最佳選擇，但很大一部分患者前來就診時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。放療是腫瘤治療中的主要手段之一，約70%的患者需要放療的參與，但放療后腫瘤往往還會復(fù)發(fā)，這多與腫瘤中存在的小部分CSCs對放療存在抵抗有關(guān)。本文就CSCs產(chǎn)生放療抵抗的機(jī)制作一綜述。

CSCs DNA損傷修復(fù)能力與放療抵抗 DNA 作為射線對細(xì)胞作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其損傷后迅速修復(fù)是放療耐受的關(guān)鍵原因[2］。DNA損傷后，首先損傷應(yīng)答激酶細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶ATM和ATR接收DNA損傷的信號，發(fā)生磷酸化，隨后激活一系列細(xì)胞周期檢測點(diǎn)效應(yīng)分子如激活效應(yīng)酶Chk2和Chk1等，最終引起細(xì)胞周期阻滯或直接進(jìn)行DNA損傷后的修復(fù)[3］。

細(xì)胞周期阻滯與DNA修復(fù) 許多研究發(fā)現(xiàn)[4-6］，不同損傷原引起DNA損傷后，機(jī)體啟動p53、ATMChk2、ATR-Chk1DNA損傷應(yīng)答通路，引起G1、S和 G2期的阻滯，使受損細(xì)胞有足夠的時(shí)間來自我修復(fù)從而產(chǎn)生放療抵抗，同樣射線引起CSCs DNA損傷后，其損傷的DNA也會通過細(xì)胞周期阻滯來進(jìn)行修復(fù)。田允鴻等[7］用無血清懸浮法富集 MCF-7細(xì)胞系中CSCs，探討其細(xì)胞周期與射線照射后產(chǎn)生耐受之間的關(guān)系，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞照射前后其細(xì)胞周期變化，Western blot法測定照射前后G2期相關(guān)蛋白pCDC25C含量，結(jié)果乳腺癌干細(xì)胞在經(jīng)射線照射前后G2期細(xì)胞含量分別為22.03% ±2.12%和45.83% ±2.25%(P ＜0.01)，pCDC25C 在照射后表達(dá)明顯增高，而貼壁培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞照射前后細(xì)胞周期及周期相關(guān)蛋白均無明顯差異，可見乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)射線照射后出現(xiàn)的G2期阻滯可能與其放療耐受特性相關(guān)。那么G2期相關(guān)蛋白pCDC25C是如何發(fā)揮作用的呢?馬曉潔[3］曾提出細(xì)胞通過G2/M期阻滯進(jìn)行自我修復(fù)涉及的路徑為損傷信號→ATM/ATR激活→Chk2/Chk1激活→CDC25CSer26位點(diǎn)磷酸化;損傷信號→ATM/ATR激活→P53激活→14-3-3σ激活，14-3-3σ與磷酸化的CDC25C結(jié)合使CDC25C磷酸酶失去對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDC2-Tyr15位點(diǎn)去磷酸化的功能→CDC2活性抑制→CDC2/cyclinbB抑制→G2，可見pCDC25C作用至關(guān)重要。Furnari等[8］提出DNA損傷后產(chǎn)生磷酸化的CDC25C的細(xì)胞會同時(shí)產(chǎn)生胞質(zhì)蛋白14-3-3δ結(jié)合點(diǎn)，最終留在胞質(zhì)不能進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致 G2/M 期阻滯。Lopez-Girona等[9］認(rèn)為DNA損傷引起細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激活，而后在Chk1及Rad24的協(xié)助下將磷酸化的CDC25C從細(xì)胞核中排除，導(dǎo)致G2/M期阻滯。Hambardzumyan等[10］提出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞產(chǎn)生放療抵抗與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Chk1、Chk2有關(guān)，用 Chk1、Chk2蛋白抑制劑 DBH將其阻斷后，細(xì)胞周期調(diào)控阻斷，經(jīng)射線照射，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系D456MG中CD133+細(xì)胞較CD133-細(xì)胞對射線的敏感性明顯增加。王彬[11］通過CD133免疫磁珠分選惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的U251中的CD133+細(xì)胞，射線照射后，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)CD133+細(xì)胞大多數(shù)處于G0～G1期，占88.2l%，G0～G1期阻止了細(xì)胞的增殖，從而對放療產(chǎn)生耐受。細(xì)胞周期阻滯會導(dǎo)致放療耐受，但其背后的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，深入了解相關(guān)腫瘤放療后其特定的周期阻滯及引起該周期阻滯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，可以進(jìn)行靶向阻斷，解除細(xì)胞周期的阻滯并最終解除放療耐受。

DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)與放療耐受 Gaedcke等[12］曾指出細(xì)胞損傷后其死亡還是存活與相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。那么CSCs放療損傷后其基因表達(dá)情況又是如何呢?陳寶敏等[13］在人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系中篩選出了與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的MGMT基因，其在常規(guī)培養(yǎng)條件下的膠質(zhì)瘤中不表達(dá)，但在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)輕度增高表達(dá);Hegi等[14］提出該基因與DNA損傷修復(fù)相關(guān)?？梢酝茰y該基因在細(xì)胞損傷修復(fù)中起重要作用。李治等[15］將人乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)過8Gy射線的照射后，發(fā)現(xiàn)其ATM和Ku70/Ku80的基因表達(dá)水平上調(diào)且表達(dá)量明顯高于非乳腺癌干細(xì)胞。ATM和Ku70/Ku80的基因產(chǎn)物能夠在細(xì)胞DNA出現(xiàn)損傷時(shí)保護(hù)損傷的DNA不被降解，并加速損傷DNA的修復(fù)，從而通過細(xì)胞凋亡產(chǎn)生放療耐受。Chang等[16］也指出敲除SirT1基因可明顯增加膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的照射敏感性，其原因可能與該基因參加細(xì)胞周期調(diào)控及DNA損傷修復(fù)相關(guān)。

除了CSCs，致瘤性間質(zhì)干細(xì)胞與射線抵抗相關(guān)的基因表達(dá)也有報(bào)道。Horsman等[17］研究產(chǎn)生放療耐受的人致瘤性間質(zhì)干細(xì)hMSC-TERT20-CE8在不同劑量的放射線下其基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CE8克隆系的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了15種已經(jīng)證實(shí)的基因過度表達(dá)，其中表達(dá)增長5倍以上的包括CTSC、GMFG、EFEMP1、NNMT、CXCL1、CASP1 基因。通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的路徑分析發(fā)現(xiàn)這些基因與腫瘤細(xì)胞致瘤性、細(xì)胞增生、細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制、重組關(guān)聯(lián)重大。其中基因NNMT的表達(dá)促進(jìn)尼克酰胺的降解和排泄，而尼克酰胺可以阻擋斷裂的單鏈DNA的修復(fù)，從而使損傷DNA的修復(fù)速率增加。這項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)BAX、CDKN1A和MDM2基因明顯增加，而這些基因表達(dá)的最終結(jié)果是促進(jìn)細(xì)胞的凋亡并將細(xì)胞阻滯在G1/S期，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂，即在腫瘤間質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞受到損傷后，既有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)，又有促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)的基因表達(dá)，因此可根據(jù)腫瘤細(xì)胞不同的基因表達(dá)水平預(yù)測其對射線的敏感性。從基因水平上探究CSCs與放射線之間的關(guān)系，有助于從基因水平上闡明CSCs抵抗放射治療的機(jī)制，提供增強(qiáng)腫瘤患者放射治療敏感性的基因靶點(diǎn)。

DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白激活或聚集與放療耐受 Marchetti等[18］提出DNA損傷后會有173種蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加和磷酸位點(diǎn)的改變，其中任瑞平等[19］總結(jié)過DNA損傷修復(fù)蛋白包括 H2AX(磷酸化組蛋白)、ATM(細(xì)胞周期蛋白)、CDKNlA(細(xì)胞周期相關(guān)酶抑制蛋白)、TP53(腫瘤抑制相關(guān)蛋白)等在DNA損傷修復(fù)中的作用。

Bao等[20］在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)CD133+的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，其經(jīng)過短期射線照射后體外培養(yǎng)的CD133+細(xì)胞比未經(jīng)照射的富集了4倍，體內(nèi)生長的腦膠質(zhì)瘤經(jīng)過同樣處理后CD133+細(xì)胞比未處理的富集了3～5倍。通過單細(xì)胞凝膠電泳測定技術(shù)發(fā)現(xiàn):無論是異體移植的膠質(zhì)瘤還是人腦膠質(zhì)瘤，在接受放療后CD133+細(xì)胞中的DNA周期檢測點(diǎn)蛋白(ATM Rad17，Chk1 and Chk2)比 CD133-細(xì)胞中的檢測點(diǎn)蛋白活性高出許多，且其存活率是CD133-細(xì)胞的4～9倍，可見DNA損傷檢測點(diǎn)蛋白的高活化狀態(tài)導(dǎo)致癌癥干細(xì)胞更有效地對損傷DNA進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果在接受放射性治療后幸存。

DNA的損傷包括單鏈和雙鏈DNA損傷，其中DNA發(fā)生雙鏈斷裂后最早反應(yīng)之一是位于斷裂點(diǎn)附近的組蛋白H2AX的c末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成 γ-H2AX[21］。Wu 等[22］提出磷酸化的 r-H2AX能快速轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA損傷信號，招募DNA損傷檢測點(diǎn)蛋白MDC1和DNA修復(fù)蛋白復(fù)合物到DNA損傷點(diǎn)形成DNA修復(fù)焦點(diǎn)。并且 Rothkamm等[23］指出無論何種因素誘導(dǎo)的雙鏈DNA的損傷都伴隨有H2AX的磷酸化，而且都要經(jīng)歷聚焦后消失的過程，可見磷酸化γ-H2AX組蛋白對于DNA損傷修復(fù)起著至關(guān)重要的作用。Booher等[24］先前的研究也發(fā)現(xiàn)，在放射治療的干預(yù)下CSCs的存活比例明顯高于非CSCs;并發(fā)現(xiàn)CSCs對射線的抵抗性增高也是通過激活細(xì)胞周期檢測點(diǎn)蛋白實(shí)現(xiàn)的，在小鼠的乳腺癌干細(xì)胞中γ-磷酸化H2AX組蛋白聚集后消融的速率明顯高于非乳腺癌干細(xì)胞，可見乳腺癌干細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)速率要快得多。Al-Assar等[25］根據(jù)CSCs特異性標(biāo)記物的不同，用熒光激活細(xì)胞/磁珠法分選不同類型腫瘤細(xì)胞系中的CSC，隨后檢測經(jīng)射線照射后其γ-磷酸化H2AX組蛋白消失速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞Panc-1和PSN-1其γ-H2AX的消失速度要快的多，提示其有耐受輻射作用。但事實(shí)上，只有乳腺癌干細(xì)胞產(chǎn)生了抵抗射線照射的結(jié)果。這說明并非所有CSCs都表現(xiàn)出輻射抵抗及γ-H2AX的快速消失，或者通過CSC表面標(biāo)記物分選CSCs的方法在研究其特性的問題上尚存在質(zhì)疑，用這種方法分選的CSCs并不能很好地表示CSCs的特性，這對以后我們分選及研究CSCs有較大的啟示。我們可以利用DNA損傷修復(fù)蛋白抑制劑特異性地阻斷CSCs的損傷后修復(fù)，進(jìn)一步提高腫瘤患者的放療敏感性。

CSCs與其微環(huán)境的相互關(guān)系

CSCs與周圍血管 董雪濤等[26］提出腦CSCs定居于血管周圍小生境中，受小生境中細(xì)胞因子和信號通路分子的調(diào)節(jié)以維持其干細(xì)胞特性、保持自我更新和分化的平衡以及是否從小生境中遷出，同時(shí)腦CSCs也分泌一些細(xì)胞因子以維持小生境結(jié)構(gòu)，破壞保護(hù)腦CSCs的小生境，可能使腦CSCs失去對不同劑量射線和化學(xué)藥物的抵抗性。李明武等[27］在腦膠質(zhì)瘤組織中，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)CSCs的標(biāo)記物CD133+和Nestin+。由此認(rèn)為，腫瘤內(nèi)微血管可能來源于CSCs的分化，推測CSCs可能以促進(jìn)血管再生及定居于血管周圍的方式使腫瘤處于足氧狀態(tài)從而產(chǎn)生輻射抵抗。

乏氧效應(yīng) 腫瘤組織內(nèi)乏氧細(xì)胞的存在是影響射線照射效應(yīng)的重要因素。細(xì)胞含氧狀態(tài)對射線輻射殺傷作用有很大影響:射線對乏氧細(xì)胞殺傷力減弱，對氧合細(xì)胞殺傷力明顯增強(qiáng)。腫瘤組織常有供血不足及乏氧細(xì)胞比率高的問題，部分癌細(xì)胞可逃避放射損傷，這是放療后腫瘤再生長及復(fù)發(fā)的常見原因之一。乏氧微環(huán)境下，乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)高表達(dá)，最新研究結(jié)果表明[28］，HIFs可以誘導(dǎo)與CSCs自我更新和多能性相關(guān)的基因表達(dá)，包括Oct4和Notchl等，它們在乏氧微環(huán)境中經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終使CSCs保持在未分化狀態(tài)或者使CSCs的分化得到抑制。Platet等[29］將3種腦膠質(zhì)瘤和2種少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤株分別在20%和3%氧環(huán)境下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3%氧環(huán)境培養(yǎng)下各種細(xì)胞株的CD133+細(xì)胞比例較20%氧環(huán)境培養(yǎng)時(shí)均明顯上升，可見乏氧環(huán)境下增殖明顯增加。Xing等[30］提出乏氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞中Notch受體和Notch配體Jagged2的表達(dá)明顯上調(diào)，而且Jagged2配體在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，其通過激活Notch信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)CSCs的自我更新。Oliveira等[31］用免疫組化分選出CD44+口腔癌干細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)在乏氧環(huán)境下其乏氧誘導(dǎo)因子σ和CD44+同時(shí)表達(dá)時(shí)對口腔癌的治療效果產(chǎn)生明顯的影響。

其他 谷胱甘肽是修復(fù)受損DNA所必需的巰基化合物，與腫瘤放射敏感性之間呈負(fù)相關(guān)。Mitchell等[32］曾經(jīng)指出高能輻射對DNA的損傷作用包括直接損傷和間接損傷，射線對DNA分子鏈的直接作用為單鏈斷裂和雙鏈斷裂;間接作用是射線對水分子的電離，產(chǎn)生自由基，自由基再與生物大分子一起作用于DNA鏈，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽作為一種自由基清除劑在亞致死腫瘤細(xì)胞的修復(fù)上起重要作用，谷胱甘肽在放療后表達(dá)水平增高與放療敏感性有很大關(guān)聯(lián)。Croker等[33］在 ALDHhiCD44+乳腺癌干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)其明顯的輻射抵抗與其細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、P糖蛋白等有關(guān)?？梢娒鞔_谷胱甘肽產(chǎn)生的來源并將其靶向阻斷有利于腫瘤放射治療的進(jìn)展。

結(jié)語 隨著CSCs在各類腫瘤中不斷被分選出來，越來越多的研究說明CSCs在腫瘤放射治療中起著重要的作用，CSCs的消滅與否關(guān)聯(lián)到腫瘤能否得到根治，而目前要想克服CSCs對各種射線的抵抗還面臨著不少的挑戰(zhàn)。首先，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究并證實(shí)CSCs輻射耐受的機(jī)制，包括射線照射后CSCs完整的DNA損傷后修復(fù)機(jī)制、基因調(diào)控、損傷修復(fù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、CSCs與小生態(tài)環(huán)境包括乏氧環(huán)境之間的相互作用機(jī)制等。其次，在明確CSCs輻射抵抗的機(jī)制后，尋求逆轉(zhuǎn)該抵抗的分子靶向治療，如以CSCs DNA損傷檢測點(diǎn)為靶點(diǎn)阻斷射線照射后DNA的修復(fù);以細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換關(guān)鍵酶為靶點(diǎn)，阻斷關(guān)鍵酶的作用，解除CSCs細(xì)胞周期的阻滯;了解射線照射后基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)后，靶向阻斷抵抗射線的基因表達(dá)而提高射線增敏基因的表達(dá);在明確乏氧環(huán)境對CSCs放射敏感性影響的前提下，探究是否可通過創(chuàng)造足氧環(huán)境提高腫瘤放射敏感性等，從而徹底消除CSCs對放射治療的抵抗，達(dá)到根治腫瘤的目的。

由此可見，解決CSCs射線抵抗將為腫瘤的根治提供良好的應(yīng)用前景。

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