解耦聯(lián)蛋白2(UCP2)與胰島β細胞功能研究進展

顧 遷(綜述) 高 鑫(審校)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年科，2內(nèi)分泌科 上海 200032)

在2型糖尿病的病理生理過程中，胰島β細胞功能持續(xù)惡化是其發(fā)生、發(fā)展的重要因素。生理環(huán)境下，胰島β細胞遵循獨特的工作模式，它并不像機體多數(shù)細胞一樣利用葡萄糖的代謝來維持細胞內(nèi)ATP/ADP比值，而是感受不同的葡萄糖水平，通過線粒體跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential，MTP，ΔΨm)的變化，改變細胞內(nèi) ATP/ADP比值，并將此作為調(diào)控胰島素分泌的信號，協(xié)調(diào)機體各組織對營養(yǎng)物質(zhì)的利用［1］。伴隨著β細胞線粒體呼吸作用、氧化磷酸化合成能量分子ATP的同時，呼吸鏈中有適量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)形成，是β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose stimulated insulin secretion，GSIS)的必要分子信號［2］;但在慢性高糖環(huán)境下，ROS產(chǎn)生過多，對β細胞造成氧化應(yīng)激損傷，抑制β細胞的功能與生存［3－6］。β細胞線粒體 ΔΨm是調(diào)控細胞內(nèi)ATP/ADP比值及線粒體ROS水平的關(guān)鍵因素。解耦聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)屬于線粒體UCP家族成員，其本質(zhì)是線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子(H+)通道，在激活后可產(chǎn)生H+滲漏，即使H+從線粒體內(nèi)膜外的胞液面回到線粒體內(nèi)膜內(nèi)的基質(zhì)面，這一作用可調(diào)節(jié)β細胞密切依賴的線粒體ΔΨm水平，目前積累的研究證據(jù)亦支持UCP2的解耦聯(lián)作用可對β細胞功能產(chǎn)生調(diào)控［7－9］。本文將總結(jié)現(xiàn)有針對UCP2調(diào)控胰島β細胞功能的體內(nèi)、外研究結(jié)果及UCP2可能的作用機制和途徑。由于從β細胞感受葡萄糖到其分泌胰島素的過程中，UCP2是一個重要的調(diào)節(jié)因子，因此闡明這種精細的調(diào)控作用可使UCP2成為頗具潛力的改善β細胞功能、治療2型糖尿病的分子靶點。

解耦聯(lián)作用與β細胞 線粒體是細胞能量代謝的中心，是底物氧化與ATP合成耦聯(lián)的場所。電子在線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上傳遞給氧生成水時，是個強烈的放能反應(yīng)，這些能量可以用于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子(H+)的轉(zhuǎn)位，即H+從線粒體的基質(zhì)面被泵出至線粒體內(nèi)膜外的胞液面，形成線粒體ΔΨm，當(dāng)H+從胞液面順梯度回至基質(zhì)面時，這部分能量可推動ATP合成酶將ADP磷酸化合成能量分子ATP。但在線粒體中，底物氧化與ADP的磷酸化耦聯(lián)作用并不是完全的，在線粒體內(nèi)膜上存在質(zhì)子滲漏的通道，由于這些通道的存在，H+被轉(zhuǎn)運回線粒體內(nèi)膜內(nèi)，而沒有用于合成ATP，稱為氧化磷酸化解耦聯(lián)作用。根據(jù)不同的細胞類型，解耦聯(lián)作用所消耗的能量可占線粒體呼吸作用總能量的20% ～70%［10］。細胞中為何要存在如此巨大的能量耗損?解耦聯(lián)現(xiàn)象在生物進化過程中一直存在，現(xiàn)在認為這種作用可使細胞的能量代謝能夠隨著機體整體的能量穩(wěn)態(tài)做出調(diào)節(jié)以適應(yīng)機體功能需求。例如在一些特定的細胞內(nèi)發(fā)揮適應(yīng)性產(chǎn)熱(棕色脂肪組織)，在低ATP需求時維持碳的流動以及調(diào)節(jié)葡萄糖感受細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)代謝反應(yīng)等作用［1］。也有學(xué)者提出“為生存而解耦聯(lián)”假說:各組織細胞為避免被線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的過量ROS損傷，通過解耦聯(lián)作用降低線粒體ΔΨm以減少ROS產(chǎn)生［11］。在體內(nèi)組織中，UCP2是繼腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、UCP1 后發(fā)現(xiàn)的具有介導(dǎo)H+轉(zhuǎn)運、產(chǎn)生解耦聯(lián)作用的線粒體內(nèi)膜蛋白［12］。多數(shù)研究結(jié)果表明UCP2不參與基礎(chǔ)狀態(tài)下線粒體氧化磷酸化的解耦聯(lián)，僅在特定因素，如高糖、高脂肪酸等激活后產(chǎn)生解耦聯(lián)效應(yīng)［13］。胰島β細胞的線粒體處于一種高度解耦聯(lián)的工作狀態(tài)，其氧化磷酸化耦聯(lián)的效率估計僅在30%左右［1］。Affourtit等［14］研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞株INS-1E細胞線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子滲漏比小鼠骨骼肌細胞高出4倍，而UCP2所致的解耦聯(lián)作用占INS-1E細胞系線粒體呼吸作用的20%，這種高度的質(zhì)子滲漏強有力地控制著線粒體ΔΨm，繼而改變ATP/ADP比值和線粒體ROS水平，調(diào)控β細胞的生理功能。

UCP2的分布和調(diào)節(jié) 自1997年克隆UCP2基因以來，相繼在多種組織中檢測到了UCP2 mRNA:包括脾臟、下丘腦、胰腺(β細胞、α細胞)、心臟、肺、白色及棕色脂肪組織、胃、睪丸、巨噬細胞;而在腦、腎臟、肝臟、肌肉等組織中則發(fā)現(xiàn)相對少量的UCP2 mRNA［15］。由于UCP2基因在巨噬細胞中有表達，而巨噬細胞又可以在體內(nèi)游走，因此UCP2的表達是否如此廣泛仍不確定。用Western blot法檢測UCP2蛋白的實驗顯示，UCP2蛋白的存在遠沒有mRNA廣泛，僅在腦、脾臟、白色脂肪組織、胰島的實質(zhì)細胞及巨噬細胞中檢測到了UCP2蛋白。值得注意的是，UCP2基因在某些器官中生理情況下并不最終表達為蛋白，而在病理狀態(tài)下卻可以啟動UCP2 mRNA翻譯為蛋白:如在肝臟中，生理情況下UCP2蛋白僅在Kuffer細胞中表達，而在肝細胞脂肪變性后，肝細胞內(nèi)可普遍表達UCP2蛋白［15］。Hurtaud 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在體外巨噬細胞、胰腺β細胞中，UCP2 mRNA與UCP2蛋白水平的變化并不一定同步。Chan等［17］最早表明在小鼠胰島中存在豐富的UCP2 mRNA與UCP2蛋白。在INS-1E細胞系中，常規(guī)培養(yǎng)液(RPMI培養(yǎng)液)下用免疫沉淀方法測得的UCP2濃度為8 ng/mg線粒體蛋白［13］。

UCP2在細胞內(nèi)的效應(yīng)受UCP2基因表達、翻譯和UCP2蛋白活性的影響。在INS-1E細胞系培養(yǎng)液中加入20 mmol/L葡萄糖后，細胞內(nèi)UCP2蛋白濃度較含2 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液時升高4～5倍［18］。在高糖、高脂環(huán)境下，UCP2基因的轉(zhuǎn)錄可在過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)、肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor，HNF)等轉(zhuǎn)錄因子的作用下上調(diào)［19］。而Sirt1、插頭框轉(zhuǎn)錄因子A1(FOXA1)及白介素-1β可以下調(diào) UCP2 基因的表達［19－20］。UCP2 mRNA 的翻譯過程受其基因上游抑制性開放閱讀框的調(diào)控，當(dāng)該開放閱讀框發(fā)生突變時，UCP2 mRNA翻譯為蛋白的能力大為提高［21］。谷氨酰胺可以抑制該開放閱讀框的作用，增加UCP2 mRNA翻譯為蛋白的水平［16］。體外研究發(fā)現(xiàn)，ROS及其氧化還原級聯(lián)反應(yīng)下游衍生物(如活性鏈烯類物質(zhì)HNE)增大線粒體ΔΨm可以上調(diào) UCP2的表達［22］。HNE除上調(diào)UCP2濃度外［23］，還可激活離體線粒體中UCP2蛋白的催化活性，即啟動UCP2蛋白將質(zhì)子轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜內(nèi)［24］。Brand 等［10－11］對這種現(xiàn)象提出了一種假設(shè):線粒體ΔΨm增加時，線粒體電子傳遞鏈中各復(fù)合物更易處于還原狀態(tài)，將單電子傳遞給氧生成ROS，在線粒體內(nèi)膜層經(jīng)歷氧化還原級聯(lián)反應(yīng)生成脂肪酸過氧化物，最終生成HNE，HNE通過某種機制(如HNE解除GDP對UCP2的抑制作用或與GDP競爭結(jié)合UCP2或與UCP2分子基團相互作用等，目前仍不明確)開放UCP2通道，降低線粒體ΔΨm，這一過程可以通過負反饋的作用降低ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護作用。而嘌呤核苷酸如ATP、GDP 及白介素-1β 則可抑制 UCP2 活性［24］。UCP2蛋白在細胞內(nèi)的半衰期很短，約1 h，可能與泛醌介導(dǎo)的蛋白酶體降解作用有關(guān)［13］。

UCP2與胰島β細胞功能 UCP2的生理功能及其在β細胞中的作用目前仍沒有得到完全闡明，但逐步積累的研究證據(jù)提示，UCP2可能從3方面參與胰島β細胞功能的調(diào)控:(1)UCP2輕度的解耦聯(lián)作用降低線粒體ΔΨm，這種解耦聯(lián)作用的即刻效應(yīng)使能量分子ATP生成減少，降低了β細胞內(nèi)ATP/ADP比值，從而抑制了胰島β細胞GSIS能力［7］;(2)UCP2的解耦聯(lián)效應(yīng)可以降低高糖、高脂環(huán)境下線粒體內(nèi)ROS水平，具有抗氧化應(yīng)激的細胞保護作用［8］;(3)ROS在胰島β細胞中不僅是毒性分子的角色，適量的ROS水平充當(dāng)著β細胞GSIS的信號分子;(4)UCP2的解耦聯(lián)作用可影響β細胞內(nèi)ROS水平，調(diào)控β細胞 GSIS 能力［9］。

UCP2對胰島β細胞GSIS的直接作用 在β細胞GSIS的經(jīng)典模式中，葡萄糖在線粒體中代謝生成ATP，升高ATP/ADP比值，抑制KATP通道，致使細胞膜去極化，開放電壓門控Ca2+通道，使細胞內(nèi)Ca2+升高，從而刺激胰島素釋放至細胞外。任何介導(dǎo)線粒體跨膜質(zhì)子內(nèi)流的過程將降低線粒體ΔΨm、線粒體氧化磷酸化效能、ATP/ADP比值及β細胞GSIS能力，因此UCP2被認為是β細胞GSIS的一個負性調(diào)控因子。離體的胰島β細胞系或胰島成為觀察UCP2對β細胞GSIS功能影響的直觀模型，上述觀點在一系列體外試驗中得到支持:如Chan等［17］最早證實在大鼠胰島中利用腺病毒載體過表達UCP2基因后，盡管胰島內(nèi)總的胰島素含量不變，但其GSIS能力嚴重受挫。且過表達UCP2基因的胰島并不能抑制給予鈣離子通道載體所誘導(dǎo)的胰島素分泌，表明UCP2對GSIS信號通路的作用部位位于鈣離子的上游［17］。Hong等［25］在胰島 β 細胞-1E細胞中亦發(fā)現(xiàn)過表達UCP2抑制β細胞的GSIS能力;而Affourtit等［14］利用 RNA干擾技術(shù)在 INS-1E細胞系內(nèi)短期抑制UCP2基因表達可迅速提高該β細胞的GSIS能力;Genipin是研究者從中藥梔子花中提取的可在線粒體水平上抑制UCP2介導(dǎo)的質(zhì)子漏而不影響線粒體其他功能的一種化合物，在ob/ob大鼠分離的胰島中給予Genipin后可以逆轉(zhuǎn)肥胖及高糖所誘導(dǎo)的β細胞功能障礙［26］。也有研究者得到不同的觀察結(jié)果:Wang等［27］觀察到在ZDF糖尿病大鼠胰島中過表達UCP2基因可以改善β細胞功能。Produit-Zengaffinen等［28］研究發(fā)現(xiàn)，過表達UCP2基因的INS-1E細胞系的GSIS功能雖然有輕微的抑制，但與對照組并沒有顯著性的差異。在前者，ZDF糖尿病大鼠本身胰島β細胞可能存在線粒體能量代謝功能障礙;在未過表達UCP2基因前，肥胖的 ZDF大鼠胰島與對照的 Zucker大鼠相比，UCP2蛋白水平降低，因此過表達UCP2基因后可能反而可將其線粒體膜功能恢復(fù)到接近生理狀態(tài)，從而觀察到改善的 GSIS能力。而在 Produit-Zengaffinen等［28］的研究中，INS-1E 細胞系過表達UCP2的水平?jīng)]有既往的研究高，可能是其沒有觀察效果的原因之一。

UCP2對β細胞線粒體內(nèi)ROS水平的調(diào)控由于ROS對β細胞的功能和生存具有關(guān)鍵的影響，因此UCP2解耦聯(lián)效應(yīng)對β細胞線粒體內(nèi)ROS水平的改變和由此產(chǎn)生的對β細胞功能的影響也受到廣泛關(guān)注。

線粒體ROS的產(chǎn)量極其敏感地依賴于線粒體ΔΨm，因此研究者們推測，UCP2輕度的解偶聯(lián)作用可減少線粒體ROS生成，預(yù)防氧化應(yīng)激損傷。1997年，Nègre-Salvayre等［29］首先證實了以線粒體解偶聯(lián)抑制劑GDP抑制胰腺及胸腺線粒體中UCP2的表達可導(dǎo)致線粒體ΔΨm增加及線粒體來源的ROS生成增加，揭示了UCP2的線粒體解偶聯(lián)作用與ROS生成的關(guān)系。繼而有多項研究證實在多種細胞中，包括神經(jīng)元細胞、肝細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等，使UCP2基因表達上調(diào)可減少ROS的氧化應(yīng)激損傷:如使腦部UCP2基因表達增加，可抑制缺血所致的ROS腦損傷、抑制神經(jīng)元細胞的凋亡［30］;過度表達 UCP2的 HepG2肝細胞內(nèi) ROS水平降低，繼而由氧化應(yīng)激損傷所致的肝細胞凋亡減少［31］。在3T3-L1脂肪細胞或巨噬細胞中過表達UCP2，抑制細胞內(nèi) ROS 的生成［32－33］;特別在內(nèi)皮細胞中，AMP激活的蛋白酶可通過上調(diào)內(nèi)皮細胞UCP2的表達，從而抑制棕櫚酸鹽誘導(dǎo)的ROS生成增加［34］。UCP2表達上調(diào)使ROS生成減少，增加內(nèi)皮細胞NO合成，改善內(nèi)皮依賴的舒張功能［35］。此外，UCP2抑制ROS生成的抗氧化應(yīng)激作用具有改善動脈粥樣硬化的效應(yīng):如將UCP2基因敲除的小鼠骨髓移植入LDL受體基因敲除的小鼠體內(nèi)，可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、動脈局部巨噬細胞的聚集、凋亡增加、膠原成分減少，斑塊局部硝基酪氨酸染色增強，更易發(fā)生動脈粥樣硬化［36］。慢性高糖、高脂環(huán)境下，過量的ROS對β細胞造成損傷，包括對β細胞合成、釋放胰島素、GSIS、線粒體能量代謝、形態(tài)及β細胞凋亡產(chǎn)生不良影響［3－6］。而在β細胞和胰島中，也觀察到了UCP2的抗氧化應(yīng)激作用:通過UCP2基因敲除抑制胰島UCP2的活性后，線粒體ΔΨm增加、胰島過氧化物生成增加、ATP水平升高［37］。UCP2抑制炎癥因子對β細胞內(nèi)過氧化物生成的誘導(dǎo):在INS-1E中過表達UCP2可以抑制細胞因子如白介素 1-β 誘導(dǎo)的 ROS 的產(chǎn)生［28］。在 Pi等［38］報道的UCP2－/－小鼠胰島中，還原型谷胱甘肽(GSH)減少、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和硝基酪氨酸增加，支持UCP2基因缺失后胰島局部氧化應(yīng)激增加，UCP2在胰島β細胞具有抑制氧化應(yīng)激的作用。以上證據(jù)表明，UCP2在多種細胞(包括β細胞)中可降低過氧化物水平，從而具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)［8］，在β細胞中葡萄糖代謝、氧化磷酸化過程中產(chǎn)生一定濃度范圍內(nèi)的ROS，特別是過氧化氫(H2O2)，是β細胞GSIS的信號分子，對β細胞功能具有促進作用。H2O2具有信號分子的一些特性:分子量小、穩(wěn)定、不帶電荷、可自由彌散，合成和降解過程迅速。在胰島β細胞中，多個與GSIS相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和過程可能受H2O2調(diào)控:包括Ca2+依賴的蛋白激酶、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、電壓門控K+通道、Ca2+的內(nèi)流和釋放、c-Jun N末端激酶(JNK)、NF-KB、SIRT1脫乙?；傅龋?］。盡管H2O2如何通過上述多種靶點分子調(diào)控β細胞GSIS仍不明確，但已有多位學(xué)者在他們的研究中證實H2O2可以刺激β細胞釋放胰島素。Collins等［31］研究發(fā)現(xiàn):短暫升高細胞內(nèi)H2O2濃度可增加β細胞胰島素分泌，給予抗氧化劑抑制葡萄糖代謝過程產(chǎn)生的H2O2可以損傷β細胞的GSIS功能。Leloup等［2］也證實線粒體來源的ROS是β細胞GSIS的必需信號分子。將β細胞短期暴露于濃度逐步升高的葡萄糖環(huán)境下，其胰島素釋放增加。此過程中不同濃度的葡萄糖代謝后致β細胞內(nèi)ATP/ADP比值發(fā)生改變的不同，無疑是調(diào)控β細胞胰島素釋放量的最強因素，但值得注意的是，ROS的生成也與該過程緊密相伴，且不是簡單的伴隨狀態(tài)。Collins等［31］及Leloup等［2］的研究表明，H2O2是繼 ATP后在 β 細胞內(nèi)將葡萄糖水平耦聯(lián)至胰島素分泌的信號分子。那么UCP2對線粒體ROS水平的調(diào)控作用，是否會影響β細胞GSIS能力?最近Brand等［10－11］觀察到:在 INS-1E 細胞系中急性抑制UCP2后，β細胞GSIS能力增強，但給予抗氧化劑后此效應(yīng)減弱。此實驗結(jié)果表明:UCP2對β細胞GSIS的調(diào)控不僅限于ATP/ADP比值的改變，其對β細胞線粒體內(nèi)ROS水平的調(diào)控，是影響β細胞GSIS作用的重要途徑。

UCP2對β細胞功能影響的體內(nèi)研究 UCP2對β細胞功能的影響比較復(fù)雜，它的解耦聯(lián)作用可直接抑制β細胞GSIS能力，又可以保護高糖、高脂環(huán)境下β細胞免于氧化應(yīng)激損傷。通過體內(nèi)研究觀察抑制或上調(diào)UCP2對β細胞功能的長期綜合效應(yīng)或許是較佳的模型，但目前的體內(nèi)研究沒有得到統(tǒng)一的結(jié)果。最早 Zhang等［39］通過構(gòu)建UCP2基因敲除(UCP2－/－)小鼠發(fā)現(xiàn)UCP2基因敲除后小鼠具有增強的GSIS能力;他們進一步在ob/ob糖尿病小鼠中敲除UCP2基因，觀察到ob/ob小鼠的血糖水平得到改善，血胰島素水平升高，葡萄糖耐量試驗中ob/ob糖尿病小鼠的1相胰島素分泌能力得到恢復(fù)。之后有研究者發(fā)現(xiàn)［7］，通過腹腔注射的方式，短期給予Swiss大鼠和ob/ob鼠UCP2反義寡核苷酸后，可改善大鼠的血糖水平、提高血胰島素濃度，使分離胰島內(nèi)的ATP含量增加、GSIS能力增強。但Produit-Zengaffinen等［28］的研究結(jié)果并不支持UCP2在體內(nèi)對β細胞功能具有顯著的調(diào)控作用，在β細胞特異性過表達UCP2的轉(zhuǎn)基因小鼠中，血漿葡萄糖及胰島素水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，小鼠的糖耐量及GSIS能力亦沒有減退。Pi等［8］構(gòu)造的 UCP2－/－小鼠模型甚至表現(xiàn)出降低的GSIS能力。在他們的UCP2－/－小鼠模型中，小鼠胰島在3 mmol/L葡萄糖環(huán)境下H2O2水平即明顯升高，16．7 mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)時，H2O2的凈增長減少。推測3 mmol/L葡萄糖濃度環(huán)境下，過高的H2O2水平使抗氧化酶水平代償性上調(diào)，干擾了生理情況下H2O2的信使作用，導(dǎo)致胰島β細胞GSIS能力減退。UCP2－/－小鼠的不一致表型可能與構(gòu)建模型時被敲除的UCP2基因附近的遺傳背景干擾相關(guān)［8］。其次對UCP2－/－小鼠β細胞功能變化的解釋需謹慎，因為在UCP2整體敲除之后，其體內(nèi)其他組織、器官、細胞，如巨噬細胞、脂肪組織、神經(jīng)元細胞(分泌POMC的神經(jīng)元)內(nèi)UCP2基因缺失后對胰島β細胞功能可產(chǎn)生間接影響。此外，在解釋糖尿病動物模型的UCP2干預(yù)結(jié)果時，需考慮不同動物模型的發(fā)病機制特點，不同模型的發(fā)病過程中UCP2的病理生理作用可能有所不同。摒除混雜因素，構(gòu)建更為精確的模型，才能進一步明確UCP2在體內(nèi)對β細胞功能的精細調(diào)控作用。

結(jié)語 UCP2的解耦聯(lián)作用可改變β細胞線粒體ΔΨm，從而影響β細胞功能。它是β細胞感受葡萄糖水平到分泌胰島素過程中的重要調(diào)節(jié)因子，但這種調(diào)控作用精細復(fù)雜，涉及多個分子和多條途徑，目前有一定的認識，尚未完全明確，因此不能簡單的將UCP2對β細胞的作用歸類為抑制或保護。構(gòu)建更為精確的體內(nèi)、外模型，探討UCP2在生理或病理情況下對β細胞內(nèi)能量代謝、ROS水平、GSIS的調(diào)控作用及機制是進一步探索的方向，其研究結(jié)果可以幫助深入理解β細胞功能障礙、2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的病理生理機制，提供新的治療靶點。

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