小口徑人工血管及其內(nèi)皮化策略的研究進展

陸樹洋(綜述) 孫曉寧 王春生(審校)

(上海市心血管病研究所-復旦大學附屬中山醫(yī)院心臟外科 上海 200032)

冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)是目前外科治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要方法之一，其中5% ～30%患者需要兩次、甚至兩次以上的CABG或存在周圍血管病變，缺乏合適的自身血管逐漸成為治療此類疾病的最大問題［1］。因此，小口徑人造血管(≤4 mm)［2］作為替代物的研究與開發(fā)成為國內(nèi)外近十年來的熱點。然而，目前所有小口徑人工血管材料都存在一個致命的共同問題:血液相容性差。當其移植入體內(nèi)后，容易導致血栓形成，遠期還易出現(xiàn)內(nèi)膜增生［1，3－4］。如果將直徑≤4 mm 的小口徑人工血管植到冠狀動脈或外周小血管，血管堵塞率很高。要解決這些問題的關(guān)鍵是促使人工血管的表面盡快內(nèi)皮化，形成具有功能的完整的內(nèi)皮層可以有效抑制血管狹窄及堵塞的發(fā)生［1］。本文旨在對小口徑人工血管及其內(nèi)皮化的策略研究進展作一綜述。

小口徑人工血管的材料選擇

聚四氟乙烯(Teflon，expanded polytetrafluor-oethylene，ePTFE) ePTFE是一種化學穩(wěn)定性極佳的新型高分子材料，其由兩層材料組成:內(nèi)層材料呈縱向性 ，外層材料呈橫向性 ，從而結(jié)合成為一種縱向、橫向都極度牢固的血管壁結(jié)構(gòu)。其管壁具有無數(shù)的微孔結(jié)構(gòu)可以提高材料的順應(yīng)性，植入人體后，組織可迅速貼敷到血管外壁上，成纖維細胞和結(jié)締組織在管壁微孔中廣泛長入，從而較易在內(nèi)壁形成完整而較薄的新內(nèi)膜。ePTFE具有較高的負電性，膜薄、光滑，發(fā)生腔內(nèi)凝血幾率相對小，與人體組織相容性較好，同時其柔順性強，易縫合，對人體無任何不良反應(yīng)，可作為體內(nèi)保持持久強度的血管代用品。ePTFE人工血管管壁沒有縱向延展性，血管壁易生成假性動脈瘤，且植覆內(nèi)皮細胞也有困難。此外，有機溶劑也可增加ePTFE人工血管移植物的多孔性和過濾性，容易形成移植物周圍血清腫。

滌綸，即聚對苯二甲酸乙二醇酯(Dacron，polyethylene terephthalate，PET) 人工血管的材料起初是用奧綸、尼龍織成，后因在生物體內(nèi)植入后結(jié)果均不理想而被淘汰?，F(xiàn)在多采用PET纖維編織人工血管，已大量應(yīng)用于臨床。臨床上使用的PET血管的編織方法主要有機織和針織兩種方式。機織的人工血管是指多股PET絲線按經(jīng)緯方向通過上下交叉編織，具有這種結(jié)構(gòu)的人工血管孔隙率小、空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，機織人工血管具有較低的出血率和較低的植入后結(jié)構(gòu)變形幾率，其缺點是可改變的機械性能不足，順應(yīng)性差，修剪邊緣易破損，與組織結(jié)合不牢固。針織人工血管是指通過PET絲線環(huán)扣成聯(lián)鎖結(jié)的編織方法進行制備。按周徑編織的人工血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，所以絕大多數(shù)針織人工血管是通過沿經(jīng)線方向進行編織的。Koper針織方法是用絲線在人工血管內(nèi)表面按垂直正交的方法來編織以增加人工血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的。另外，利用編絲絨的方法在織物表面延長絲線圈的長度從而增加人工血管與組織的結(jié)合，人工血管外側(cè)面的絨毛狀絲線能保證人工血管跟周圍組織的結(jié)合，但是內(nèi)側(cè)面的絨毛結(jié)構(gòu)會增加纖維蛋白和血小板的固定。針織人工血管不足之處在于管壁皺折，有高度的多孔性，網(wǎng)孔較大，移植時滲血現(xiàn)象嚴重，使用前必須預凝。此外，與ePTFE相比，PET與周圍組織反應(yīng)較強，易激活血小板，抗血栓形成性較低，生物相容性也較差，炎性反應(yīng)重。

聚氨酯(polyurethane，PU) PU是一種具有良好的理化性能、血液相容性和生物相容性的醫(yī)用高分子材料。其具有良好的順應(yīng)性、韌性和彈性，耐磨、耐腐蝕，易加工，能采用通常的方法滅菌，還具有抗凝血功能，無致畸變作用，無過敏反應(yīng)?？筛鶕?jù)設(shè)計的要求，通過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計調(diào)整其物理化學性質(zhì)。由于其具有優(yōu)秀的機械性能，因此可通過加工技術(shù)控制孔隙度，調(diào)整達到與天然血管順應(yīng)性的匹配。然而，目前尚沒有足夠的證據(jù)說明PU人工血管優(yōu)于ePTFE和PET人工血管，而且，有動物實驗提示PU降解后產(chǎn)物2，4-甲基苯二胺具有致癌作用。

促進內(nèi)皮化的途徑 目前，促進組織工程血管內(nèi)皮化的主要途徑有兩種:一是內(nèi)皮細胞體外種植法，包括單期種植法、二期種植法以及自體靜脈碎片快速種植法，二是內(nèi)皮細胞體內(nèi)原位表面化。

單期種植法:將用機械法或酶解法獲取的新鮮內(nèi)皮細胞在手術(shù)前較短的時間內(nèi)種植于人工血管的管壁，然后直接用于手術(shù)。此種方法簡便易行，然而直接獲取的內(nèi)皮細胞數(shù)量有限，并且種植的內(nèi)皮細胞抗血流切應(yīng)力差，難以確保種植后形成完整的內(nèi)膜。二期種植法:將獲取的內(nèi)皮細胞先行離體培養(yǎng)，再高密度種植于人工血管表面。二期種植法較單期種植法可以獲取足夠的細胞數(shù)量，但是，體外內(nèi)皮細胞種植法需要耗費大量的財力以及時間，需要具備一定的實驗室硬件，同時，操作者需要具備嫻熟的內(nèi)皮細胞/內(nèi)皮祖細胞的體外分離及擴增的能力。

內(nèi)皮細胞體內(nèi)表面內(nèi)皮化主要有以下理論:(1)宿主血管內(nèi)皮細胞從吻合口向人工血管的遷移，但是內(nèi)皮化僅限于吻合口周圍2 cm。(2)周圍組織毛細血管內(nèi)皮細胞通過人工血管壁的長入。周圍組織的成纖維細胞、內(nèi)皮細胞可以從多孔人工血管壁長入而形成人工血管內(nèi)膜?？讖綖?0 μm左右的多孔人工血管材料較為理想。(3)循環(huán)內(nèi)皮細胞在人工血管內(nèi)表面的沉積。由于體外種植法的種種弊端，利用自體內(nèi)皮細胞/內(nèi)皮祖細胞促進移植物在體內(nèi)表面內(nèi)皮化成為近年來研究的熱點。

促進內(nèi)皮化細胞的選擇 組織工程血管內(nèi)皮化細胞來源包括成熟的內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞以及多能干細胞。諸多研究認為內(nèi)皮祖細胞可能是內(nèi)皮化細胞的良好選擇。內(nèi)皮祖細胞是一類未分化的成體干細胞，具有增殖和分化為成熟內(nèi)皮細胞的潛能，它和胚胎源性成血管細胞具有相似的性狀，主要來源于骨髓。健康個體外周血中內(nèi)皮祖細胞的水平非常低，但粒細胞集落刺激因子或血管內(nèi)皮生長因子可動員骨髓中內(nèi)皮祖細胞釋放到外周血中。成熟內(nèi)皮細胞屬于終末分化細胞，分裂增生修復損傷內(nèi)皮的潛能很低，而內(nèi)皮祖細胞修復能力很強，同時可以促進新生血管形成。大量體外及體內(nèi)研究表明［5－6］，內(nèi)皮祖細胞可以通過促進損傷血管再內(nèi)皮化以及誘導缺血缺氧區(qū)的新生血管形成改善缺血器官的功能。一些研究者通過全身系統(tǒng)應(yīng)用內(nèi)皮祖細胞，促進其歸巢到受損血管，可以有效促進其內(nèi)皮化［7］。早期的一些研究同樣表明［8－9］，在人工血管表面體外種植外周血來源或骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞可以在人工血管表面形成具有抗血栓性質(zhì)的內(nèi)皮界面。

促進小口徑移植血管在體內(nèi)皮化的策略

接枝抗循環(huán)EC/EPC膜受體的抗體 在人造血管表面形成光滑的內(nèi)皮層是提高人工血管血液相容性、改善遠期通暢率的最好途徑。已有實驗表明將體外種植CD34陽性細胞的人工血管移植至動物體內(nèi)可以實現(xiàn)快速內(nèi)皮化，減少血栓形成幾率，提高血管的通暢率。然而，體外種植法的種種弊端使其難以普及。近年的研究發(fā)現(xiàn)人體外周血液循環(huán)中存在多潛能內(nèi)皮祖細胞，可定向分化為內(nèi)皮細胞，具有再生功能，在受損部位可加速血管內(nèi)皮化［10］。設(shè)計針對內(nèi)皮祖細胞/內(nèi)皮細胞表面分子標簽 CD34/CD133/VEGF-1、2的抗體，接枝到移植物的表面來捕捉循環(huán)中的內(nèi)皮祖細胞及內(nèi)皮細胞，較短時間內(nèi)可實現(xiàn)內(nèi)皮化。Rotmans等［11］研究可捕獲CD34抗原陽性的內(nèi)皮祖細胞的功能性人工血管，雖然植入豬體內(nèi)后人工血管可以很快內(nèi)皮化，但內(nèi)膜仍然增生顯著，未能有效控制再狹窄。失敗原因在于研究應(yīng)用的CD34內(nèi)皮祖細胞捕獲存在著局限性，所捕獲的CD34抗原陽性內(nèi)皮祖細胞存在以下特點:(1)抗原的特異性低，CD34抗原不是只表達在相對成熟的內(nèi)皮祖細胞上，也表達在成熟脫落的內(nèi)皮細胞上;(2)CD34+細胞可以分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等，因此，CD34+抗體捕獲的細胞仍有向血管平滑肌細胞分化的潛力，且捕獲的EPC分泌細胞生長因子(VEGF和HGF)，對EPC和血管平滑肌細胞都有擴增的作用，可導致內(nèi)膜過度增生。研究發(fā)現(xiàn)［12－13］，CD133抗原陽性內(nèi)皮祖細胞可以從外周血的單個核細胞分離，并在支持內(nèi)皮分化的培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)，內(nèi)皮祖細胞對于剪切應(yīng)力易于形成管狀結(jié)構(gòu)。CD133是一個高度保守的抗原，它只表達于未成熟的內(nèi)皮祖細胞，在成熟的內(nèi)皮細胞和單核細胞上不表達。外周血中內(nèi)皮祖細胞廣泛存在，且?guī)в蠧D133抗原的內(nèi)皮祖細胞具有更好的分化潛能、表達及分化特異的特點，因此，捕獲CD133抗原陽性的內(nèi)皮祖細胞支架可能會有更好的效果，目前國際上尚無此類研究報道。

接枝EC/EPC整合素特異性識別的功能性短肽整合素是細胞膜調(diào)控細胞黏附到材料表面最主要的蛋白，它有兩種跨膜糖蛋白亞單位構(gòu)成，α鏈和β鏈，它們以非共價鍵形式結(jié)合在一起。在膜外部分的α鏈和β鏈相互作用，形成功能化的異二聚體。整合素通過膜外部分結(jié)構(gòu)與細胞外基質(zhì)發(fā)生作用，通過細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)與細胞骨架和信號分子發(fā)生作用，進而調(diào)節(jié)細胞黏附、運動、鋪展、生長和分化。

RGD序列是組織工程領(lǐng)域最常用的功能性短肽，把其固定到人工材料的表面可以促進細胞的黏附，它存在于許多細胞外基質(zhì)蛋白中，如纖粘連蛋白、波形蛋白以及膠原等。具有特定空間構(gòu)象的短肽序列RGD作為配體與整合素特異性的結(jié)合而介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)材料的黏附、遷移和增殖。Blindt等［14］研究發(fā)現(xiàn)把環(huán)狀RGD(cRGD)包被到支架表面，體外及體內(nèi)實驗均證實其可以有效招募內(nèi)皮祖細胞，抑制冠狀動脈內(nèi)膜增生。此外，REDV以及SVVYGLR功能性短肽序列也可以被整合素識別，介導細胞的黏附增殖以及遷移。

包被磁性分子 通過使用磁力促進內(nèi)皮祖細胞滯留是促進內(nèi)皮化的另外一種方法。Consigny等［15］首次提出通過外界磁場使得鐵負荷的細胞在組織局部滯留的概念。然而，細胞黏附主要出現(xiàn)在磁場附近，需要較長的時間才能實現(xiàn)內(nèi)皮化。Pislaru等［16］研究通過使PET人工血管進行磁性處理，促進超順磁性標記的內(nèi)皮細胞黏附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組促進內(nèi)皮細胞黏附能力有顯著差異。隨后使用流動小室對黏附的細胞進行剪切力實驗，流速在300 mL/min的情況下，有70%的細胞可以滯留，流速達到400 mL/min時仍有61%的細胞可以滯留。豬頸動脈血管移植模型進一步證實了磁力可以實現(xiàn)快速內(nèi)皮化。Pislaru等［17］把這一技術(shù)理論運用到支架上，同樣證實了磁性處理后的支架可以有效促進超順磁性標記的內(nèi)皮組細胞，是對照組的6～30倍。

與上述使用cRGD功能性短肽以及CD34抗體捕捉內(nèi)皮祖細胞不同的是，通過磁力捕捉內(nèi)皮祖細胞首先需要分離和磁性標記內(nèi)皮祖細胞。然而，內(nèi)皮祖細胞體外的分離培養(yǎng)需要時間較長，而且超順磁性微球標記費用昂貴，該種方法很難運用于急診患者。此外，鐵負荷的內(nèi)皮祖細胞遠期作用以及他們能否有效促進內(nèi)皮化尚不清楚。超順磁性或鐵標記的內(nèi)皮祖細胞釋放鐵微球顆?？梢约ぐl(fā)局部炎性反應(yīng)，而且其不可生物降解。Pislaru等［17］使用鎳材料包被支架，在一些個體上還出現(xiàn)了過敏反應(yīng)。因此，進一步研究生物相容性的細胞標記顆粒以及磁性材料是該技術(shù)遠期研究的關(guān)鍵步驟。

包被特異性結(jié)合EC/EPC的適體 適體(aptamers)來源于拉丁文，意思就是適合，它是單鏈核酸，通常由70～80個核苷酸構(gòu)成，對于許多靶分子具有高度的親和力和特異性，如肽、蛋白質(zhì)、藥物、有機或無機分子，甚至是整個細胞［18－22］。能與靶分子識別的基礎(chǔ)是單鏈寡核苷酸所形成的復雜的空間三維結(jié)構(gòu)。1990年首次報道［23－24］適體的產(chǎn)生通常需要在體外與配體相互作用進行選擇和擴增的過程，稱為通過指數(shù)濃縮向心配體的系統(tǒng)演變(SELEX)。這種方法通過使用一對引物序列從多達1 015種不同核苷酸序列庫中化學合成出可以和靶分子高親和力結(jié)合的核酸配體。分離出來的適體和靶分子具有高度的親和力，他們的離解常數(shù)從納米級到皮克級，不遜于甚至優(yōu)于單克隆抗體。與抗體相比，適體在診斷分析方面有下面一些優(yōu)勢:首先，適體是通過體外過程制備，不需要依賴動物或者細胞等在體環(huán)境。正因為這些，可以為一些具有毒性的以及無免疫原性的靶分子制備適體。適體的生物利用度以及藥代動力學可以通過化學修飾來保護適體在生物環(huán)境中不失活，比如通過化學修飾使適體可以抵抗核酸酶的消化。再者，適體易于長期存放，同時變性有可逆性。一旦失去活性也可以在數(shù)分鐘內(nèi)恢復本來的構(gòu)象。

Hoffmann等［25］使用SELEX技術(shù)合成了對循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞具有高度親和力的適體。因為缺乏豬內(nèi)皮祖細胞表面分子標簽(CD133，CD34和VEGFR-2的單克隆抗體)，他們使用鼠抗豬CD31抗體包被磁珠來分離CD31陽性細胞。CD31分子廣泛表達在白細胞、血小板、內(nèi)皮細胞以及循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞的表面。通過運用SELEX技術(shù)，他們合成單鏈DNA適體針對豬CD31陽性細胞亞群，通過流式細胞儀挑選出72%的CD31陽性細胞。這些適體需要共價結(jié)合到高分子聚合材料上，進一步評估它們在流體狀態(tài)下的性能。把適體包被到人工材料表面可以特異性捕捉內(nèi)皮祖細胞，使得材料抗炎、抗栓能力增強，使其在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)內(nèi)皮化。把對內(nèi)皮祖細胞有高親和力的適體以及無意義的適體分別包被到材料表面，通過豬在體實驗驗證，發(fā)現(xiàn)實驗組適體可以豬血液循環(huán)中捕捉CD31以及CD144陽性細胞，而對照組材料表面沒有此類細胞貼覆。經(jīng)過培養(yǎng)10天，這些細胞表達內(nèi)皮細胞特性。該研究表明適體在流體環(huán)境下可以捕捉循環(huán)中的內(nèi)皮祖細胞。目前，還有在體實驗研究適體在捕捉內(nèi)皮祖細胞促進心梗后心肌修復過程的優(yōu)勢。這種新型的分子技術(shù)對促進植入體內(nèi)材料的內(nèi)皮化有著非常有益的作用。通過有效的捕捉內(nèi)皮祖細胞可以縮短內(nèi)皮化的時間，提高臨床醫(yī)用材料的應(yīng)用，同時也豐富了組織工程技術(shù)。

人工血管的基因修飾 人工血管的基因修飾是利用基因工程技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)入到人工血管內(nèi)皮化的內(nèi)皮細胞中，增強其分泌細胞因子的能力，促進其黏附生長以及抗血栓功能。目前，已有多種基因，如beta半乳糖基因、組織型纖溶蛋白原基因、血管內(nèi)皮細胞生長因子基因和血栓調(diào)節(jié)蛋白基因等用于內(nèi)皮細胞基因修飾研究，體內(nèi)及體外實驗研究也初步顯示了這一技術(shù)的良好前景。然而，在取得一定進展的同時，也存在一些需要解決的問題:基因修飾后使得內(nèi)皮細胞在獲得新功能的同時，其黏附性及增殖功能也受到影響。

結(jié)語 小口徑人工血管移植后遠期通暢率的問題仍然是目前亟待解決的首要問題。盡管目前促進內(nèi)皮化的方法有很多，但每種方法都有其缺陷，沒有一種能從根本上解決遠期通暢率問題。理想的人工血管植入體內(nèi)需要具有良好的力學性質(zhì)，同時還能發(fā)揮一定的正常血管的生理功能。單純從內(nèi)皮化的角度可能還遠遠不夠，還要從人工血管材料以及基因修飾等多種手段，綜合提高小口徑血管臨床應(yīng)用所面臨的問題。

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