HPLC法測定雙唑乳膏中克霉唑與硝酸益康唑的含量*

馬若群，丁蘇蘇，徐興亞，聞琍毓，李倚云

(1. 揚州市藥品檢驗所，揚州　225009；　2. 揚州市疾病預防控制中心皮膚病性病防治所，揚州　225009)

雙唑乳膏是由硝酸益康唑與克霉唑兩組分按1∶1配成的乳膏制劑，其中克霉唑與硝酸益康唑分別為吡咯類抗真菌藥與咪唑類抗真菌藥，均通過干擾細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌麥角固醇等固醇的生物合成?，F(xiàn)存主要劑型為雙唑癬藥水[1]，收錄于中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局編輯出版的《中國醫(yī)院制劑規(guī)范》(西藥制劑第2版)。該制劑的兩組分聯(lián)合用藥的廣譜抗霉菌作用及治療濕疹、頭癬、體癬及手足癬等功效得到了醫(yī)院臨床的認可[2,3]。與藥水制劑相比，乳膏制劑具有依從性好、使用方便、性質(zhì)穩(wěn)定、溶解性能較好等優(yōu)點[4]，故雙唑乳膏的開發(fā)成為一個頗具前景的研究課題。《中國藥典》未收載兩種成分同時測定的方法，文獻報道有關雙唑癬藥水的含量測定方法多為多波長紫外吸收法[1,5,6]。本文參考《中國藥典》中克霉唑乳膏與硝酸益康唑乳膏各自的含量測定方法[7]，建立了以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀各2.5 g，加水溶解并稀釋至1000 ml)-甲醇(25∶75)為流動相的高效液相色譜法同時測定兩組分含量，操作簡便，結果滿意。

1　儀器與試藥

Shimadzu LC-20 AB型高效液相色譜儀(SPD-20 A檢測器，SIL-20 AC系統(tǒng)進樣器，CTO-20 AC型柱溫箱，CBM-20 Alite型系統(tǒng)控制器)；梅特勒公司AB135-S電子分析天平；克霉唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所提供，批號100037-200306，規(guī)格約50 mg，含量100%，105 ℃干燥2 h后使用)，硝酸益康唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所提供，批號100214-199802，規(guī)格約50 mg，含量100%，105 ℃干燥1 h后使用)；雙唑乳膏(江蘇省揚州市疾病預防控制中心皮膚病性病防治所提供，規(guī)格50 g/盒，批號121214、121224)，甲醇為色譜純(Dikma公司)，水為純化水。

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Alltech Alltima C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀各2.5 g，加水溶解并稀釋至1000 ml)-甲醇(25∶75)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：232 nm；進樣量：20 μl；理論板數(shù)按克霉唑峰計算，不低于4000，克霉唑峰與硝酸益康唑峰的分離度應符合要求。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液的制備精密稱取克霉唑與硝酸益康唑各10 mg，置同一100 ml量瓶中，加甲醇75 ml使溶解，用磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為1號儲備液；精密量取1號儲備液5 ml，置100 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為2號儲備液。

2.2.2對照品溶液的制備精密量取1號儲備液5 ml，置10 ml量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取本品1 g(約相當于克霉唑與硝酸益康唑各5 mg)，精密稱定，置100 ml量瓶中，加甲醇75 ml，置75 ℃水浴中溫熱5 min，時時振搖，取出后強烈振搖5 min，使克霉唑與硝酸益康唑充分溶解，冷卻，用磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻2 h，取濾膜迅速濾過，待續(xù)濾液放置至室溫，精密量取續(xù)濾液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2.4陰性對照溶液的制備取除克霉唑與硝酸益康唑以外的其他組分，按處方配比配制成陰性對照，按“2.2.3”供試品溶液的處理方法，同法制得陰性對照溶液。

2.3專屬性試驗精密量取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各20 μl，在上述色譜條件下進行分析，結果顯示，克霉唑的保留時間約為9.2 min，硝酸益康唑的保留時間約為13.9 min，樣品中其他成分峰不干擾克霉唑與硝酸益康唑的測定，見圖1。

2.4線性關系考查分別精密量取“2.2.1”項下的1號儲備液2、5、10和15 ml與2號儲備液1、2和10 ml置20 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取1、2號儲備液與上述溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以克霉唑與硝酸益康唑的峰面積(A)對其濃度(C)進行線性回歸，回歸方程分別為克霉唑A=2.1629C+1.3954(r=0.9999,n=9)；硝酸益康唑A=2.8602C+1.4205(r=0.9999,n=9)。結果表明克霉唑與硝酸益康唑在0.25～100 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

1. 克霉唑　2. 硝酸益康唑

2.5精密度試驗取批號為121224的樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液1份，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，克霉唑與硝酸益康唑色譜峰峰面積的RSD分別為0.8%與1.0%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2．6檢出限與定量限精密量取2號儲備液，用流動相逐級稀釋至刻度，搖勻。精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果檢出在克霉唑與硝酸益康唑的濃度為50 ng/ml時，S/N分別為2.96與5.70，按3倍信噪比計算，將檢出限定為50 ng/ml。定量限定為標準曲線的最低點，0.25 μg/ml。

2．7重復性取批號為121224的樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下連續(xù)進樣2次，克霉唑與硝酸益康唑色譜峰峰面積的RSD分別為0.9%與1.0%(n=6)。結果表明方法的重復性良好。

2．8穩(wěn)定性取精密測定項下制備的樣品溶液，在上述色譜條件下于0、1、2、3、4、6和8 h分別進樣，記錄各色譜峰峰面積，克霉唑與硝酸益康唑色譜峰峰面積的RSD分別為1.1%與1.4%(n=7)。結果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9回收率試驗稱取批號為121214的樣品9份，每份約0.25 g(約相當于克霉唑與硝酸益康唑各1.25 mg)，精密稱定，置50 ml量瓶中，精密量取克霉唑?qū)φ掌?9.80 mg與硝酸益康唑?qū)φ掌?0.49 mg，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取2、3和5 ml各三份，分別加入上述9個50 ml量瓶中，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液。精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示克霉唑與硝酸益康唑的回收率分別為99.87%與101.11%，RSD分別為1.4%與1.8%，見表1和表2。

表1　樣品中克霉唑的回收率試驗結果

表2　樣品中硝酸益康唑的回收率試驗結果

2．10供試品含量測定取批號為121224、121214的樣品，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行含量測定，以外標法計算含量，結果見表3。

表3　樣品含量測定結果

3　討論

3.1劑型的選擇關于克霉唑與硝酸益康唑聯(lián)合用藥取得較好臨床效果的報道屢見報端，制成復方劑型可以方便患者使用，提高依從性。而現(xiàn)在唯一存在的復方劑型為雙唑癬藥水，且僅為醫(yī)院制劑，涂布不均勻。在臨床使用上，乳膏劑具有保護創(chuàng)面、潤滑皮膚等天然優(yōu)勢，可以起到更好的治療效果。并且克霉唑與硝酸益康唑的穩(wěn)定性較好，制成乳膏劑后的含量測定提純過程可有效規(guī)避樣品處理過程中降解情況的發(fā)生。

3.2波長的選擇根據(jù)《中國藥典》2010年版二部中克霉唑與硝酸益康唑含量測定項下的規(guī)定，兩者的檢測波長分別為215 nm與232 nm，實際檢測中發(fā)現(xiàn)兩者無顯著性差別，而232 nm時兩者的吸光度更接近，為避免甲醇截止波長的影響，故選擇232 nm作為檢測波長。

3.3流動相選擇根據(jù)《中國藥典》2010年版二部中克霉唑與硝酸益康唑含量測定項下的規(guī)定，兩者的流動相也較為接近，克霉唑為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(70∶30)(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.7～5.8)，硝酸益康唑為磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀各2.5 g，加水溶解并稀釋至1000 ml)-甲醇(10∶30)。經(jīng)比對，后者樣品峰形更好，拖尾現(xiàn)象更輕，故采用硝酸益康唑較高濃度的磷酸鹽緩沖液。同時調(diào)整有機相濃度，使兩主峰在15 min之內(nèi)出峰。最終選擇磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀各2.5 g，加水溶解并稀釋至1000 ml)-甲醇(25∶75)為流動相。

本文為克霉唑與硝酸益康唑聯(lián)合用藥的新劑型——雙唑乳膏建立了高效液相色譜儀測定雙唑乳膏中克霉唑與硝酸益康唑含量的方法。實驗表明該方法分離效果良好，方法靈敏度高，專屬性強，方法可靠。 建議該方法用于雙唑乳膏的含量測定。

1王桂芳, 張守堯, 沈霞, 等. 雙波長紫外分光光度法測定雙唑癬藥水中益康唑克霉唑的含量[J]. 藥學實踐雜志, 1998, 16(2): 100

2梁宗夏, 王筑, 周淑琴, 等. 硝酸益康唑栓劑聯(lián)合克霉唑軟膏治療念珠菌陰道炎的療效觀察[J]. 海南醫(yī)學, 2006, 17(7): 105

3袁惠英. 硝酸益康唑栓劑治療念珠菌性陰道炎療效分析[J]. 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報, 2006, 1(17): 129

4程萬清, 葉小文. 乳膏劑的研究進展[J]. 醫(yī)藥導報, 2008, 27(3): 312

5程獻,黃立新,朱忠華. 多波長直線回歸法測定雙唑癬藥水中益康唑和克霉唑含量[J]. 廣東藥學院學報, 1997, 13(4): 256

6王桂芳, 張守堯, 楊海恩. 高效液相色譜法測定雙唑癬藥水中益康唑和克霉唑含量[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 1998, 18(4): 157

7中國藥典[S].二部.2010: 320,954