局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對脛骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響

胡四平 汪衛(wèi)星 劉洋 吳鶴芬 余亮 劉鶴 王翔

局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對脛骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響

胡四平 汪衛(wèi)星 劉洋 吳鶴芬 余亮 劉鶴 王翔

目的 觀察局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對脛骨癌痛的緩解作用。 方法 選取32只雌性SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為4組，空白對照組（Cont組）、假手術(shù)組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）和骨癌痛聯(lián)合阿米洛利組（A組），各8只。BCP組和A組大鼠在脛骨上端骨髓腔內(nèi)注射5μl Walker-256乳腺癌細胞制備脛骨癌痛模型，建模成功后第7天于脛骨上端區(qū)分別注射0．9%氯化鈉溶液和阿米洛利溶液各100μl；Sham組大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注射等體積Hank液，并于相同時間點在脛骨上端區(qū)注射0．9%氯化鈉溶液100μl。分別于注射Walker-256乳腺癌細胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0．9%氯化鈉溶液后30min（T2）、1 h（T3）、2 h（T4）、4 h（T5）、8 h（T6）時檢測各組大鼠機械縮足閾值（MWT）和自由行走疼痛評分。 結(jié)果 與T0比較，BCP組和A組各時點MWT值、自由行走疼痛評分的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時點MWT值、自由行走疼痛評分的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與BCP組比較，A組T2～T5MWT值、自由行走疼痛評分的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與T1時比較，A組T2～T5MWT值、自由行走疼痛評分的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結(jié)論 局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利可有效緩解脛骨癌痛大鼠的疼痛行為。

骨腫瘤 疼痛 阿米洛利

既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織參與疼痛的進展，其分子機 制十分復雜且不明確[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，初級感覺神經(jīng)元上的酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）可由癌癥骨轉(zhuǎn)移形成的酸性微環(huán)境激活產(chǎn)生疼痛信號[2]。阿米洛利（amiloride）作為ASICs的非選擇性抑制劑，可以明顯緩解急性和慢性炎性疼痛[3-4]，但其對癌痛的影響尚未見報道。本實驗利用大鼠脛骨癌痛模型，觀察局部注射阿米洛利對骨癌痛大鼠疼痛行為學的影響，為臨床骨癌痛的治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠32只，體重160～180 g，由浙江大學實驗動物中心提供。實驗前所有大鼠靜養(yǎng)適應1周，晝夜交替照明（8∶00～20∶00），室溫21～25℃，濕度40%～60%，自由攝食、飲水。Walker-256腫瘤細胞（中國上海生物醫(yī)學工程研究所），Von Frey纖絲（美國Stoelting公司），阿米洛利（美國Sigma公司）。

1.2 方法 按隨機數(shù)字表法分成4組，空白對照組（Cont組）、假手術(shù)組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）和骨癌痛聯(lián)合阿米洛利組（A組），每組各8只。BCP組和A組大鼠參照文獻[5]方法制備脛骨癌痛模型，采用體外培養(yǎng)Walker-256乳腺癌細胞，密度為2×107/ml。10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，右側(cè)后肢剪毛、消毒皮膚，切開皮膚暴露脛骨上端，針尖在脛骨干骺端穿刺打孔后，微量注射器刺入骨髓腔緩慢注射5μl Walker-256乳腺癌細胞的培養(yǎng)液，注射后骨蠟迅速封堵針孔并涂抹醫(yī)用膠水，消毒后組層縫合切口，局部涂抹紅霉素眼膏預防感染。Sham組大鼠右側(cè)脛骨注射等體積Hank液，其余操作同上。建模成功后第7天BCP組與A組于脛骨上端分別注射0.9%氯化鈉溶液和阿米洛利溶液100μl，Sham組注射0.9%氯化鈉溶液100μl，Cont組不做任何處理。

1.3 機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）測定 將有機玻璃箱置于鐵絲網(wǎng)格上，大鼠置于有機玻璃盒預適應30min，以不同力度的Von Frey纖毛刺激大鼠足底，按照升序從1g開始，最大刺激力度為26g。以纖毛稍稍彎曲作為完全受力標準，持續(xù)刺激5s，連續(xù)5次，每次至少間隔30s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為為陽性反應。若3次不抬腿，換高一級克數(shù)的纖毛；有3次抬腿，則返回低一級克數(shù)的纖毛，直到每5次測試中有3次抬腿。5次中能夠引起3次抬腿的最低Von Frey纖毛克數(shù)計為MWT值。分別于注射Walker-256乳腺癌細胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0.9%氯化鈉溶液后30min（T2）、1h（T3）、2h（T4）、4h（T5）、8h（T6）時測定各組大鼠MWT值。

1.4 自由行走疼痛評分 參照文獻[5]評分標準觀察大鼠自由行走疼痛行為：0分，大鼠行走正常；1分，造模側(cè)后肢使用正常，輕度跛行；2分，介于1分和3分之間；3分，造模側(cè)后肢嚴重跛行；4分，造模側(cè)后肢不能著地。1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組內(nèi)比較采用重復測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠MWT值的比較 與T0比較，BCP組和A組各時間點MWT值較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Cont組和Sham組各時點間MWT值的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時間點MWT值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Sham組各時間點MWT值無明顯差異（P＞0.05）；與BCP組比較，A組T2～T5MWT值較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），T1時無明顯差異（P＞0.05））；與T1比較，A組T2～T5MWT值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠不同時點MWT比較（與T0比較，*P＜0.05；與Cont組比較，#P＜0.05；與BCP組比較，§P＜0.05；與T1時比較，△P＜0.05）

2.2 各組大鼠自由行走疼痛評分比較 與T0比較，BCP組和A組各時點自由行走疼痛評分較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Cont組和Sham組各時點間自由行走疼痛評分的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時點自由行走疼痛評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），Sham組各時點自由行走疼痛評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與BCP組比較，A組T2～T5自由行走疼痛評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），T1無明顯差異（P＞0.05）；與T1時比較，A組T2～T5自由行走疼痛評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

癌癥骨轉(zhuǎn)移最常見的并發(fā)癥是骨癌痛，既嚴重影響患者的生活質(zhì)量又易引發(fā)其他并發(fā)癥?！鞍┩慈A梯療法”是目前癌痛的主要治療方法，但尚有不少患者得不到有效緩解。當患者為緩解疼痛而使用大劑量強效阿片類藥物治療時，極易引發(fā)嚴重的不良反應甚至危及生命。因而，尋求有效的藥物和方法是臨床癌痛治療中關(guān)注的焦點。

圖2 各組大鼠不同時間點自由行走疼痛評分比較（與T0比較，*P＜0.05；與Cont組比較，#P＜0.05；與BCP組比較，§P＜0.05；與T1時比較，△P＜0.05）

局部組織酸化是癌癥骨轉(zhuǎn)移過程中重要的病理生理過程，由轉(zhuǎn)移的癌細胞、骨吸收的破骨細胞及炎癥細胞等產(chǎn)生的大量質(zhì)子而形成局部酸性微環(huán)境[6-8]。動物實驗以及人類骨癌痛的研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞既是骨喪失中的重要角色，也參與骨癌痛形成：破骨細胞和腫瘤細胞均能釋放H+維持骨腫瘤局部酸性微環(huán)境（pH 4.0～5.0），可能在骨癌痛產(chǎn)生過程具有重要作用[9]。ASICs作為質(zhì)子受體，是一種質(zhì)子門控陽離子通道，包括7個亞單位：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4，主要表達在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，其中ASIC1b和ASIC3大量表達在包括背根神經(jīng)節(jié)在內(nèi)的外周神經(jīng)系統(tǒng)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ASICs mRNA表達和活性可在炎癥引起的酸性條件下增加，特別是ASIC3與降鈣素基因相關(guān)肽陽性神經(jīng)共表達在支配骨膜表面的感覺神經(jīng)元上，提示ASICs在組織酸化引起的疼痛中發(fā)揮重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)：（1）MWT值：與T0比較，BCP組和A組各時間點自由行走疼痛評分較高；與Cont組相比，BCP組和A組各時間點自由行走疼痛評分升高。（2）自由行走疼痛評分：與T0比較，BCP組和A組各時間點自由行走疼痛評分較高；與Cont組相比，BCP組和A組各時間點自由行走疼痛評分升高。本研究結(jié)果與上述理論相符。因此，針對骨腫瘤局部酸性微環(huán)境和ASICs進行干預，可能成為骨癌痛治療的有效靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨癌痛模型建立后第7天MWT值明顯降低，與文獻報道一致[12]，提示模型建立成功，故本研究選擇模型建立后第7天注射阿米洛利檢測各組大鼠MWT值變化是正確的。本研究結(jié)果顯示：（1）MWT值：與BCP組比較，A組T2～T5MWT值較高；與T1時比較，A組T2～T5MWT值升高。（2）自由行走疼痛評分：與BCP組比較，A組T2～T5自由行走疼痛評分降低；與T1時比較，A組T2～T5自由行走疼痛評分降低。該結(jié)果表明使用ASICs的抑制劑阿米洛利可以明顯抑制大鼠骨癌痛模型MWT值的降低及自由行走疼痛評分，其機制可能為阿米洛利抑制癌癥局部ASICs活性，阻斷ASICs下游信號通路，從而抑制外周疼痛信息向脊髓以上中樞傳遞，但目前本研究僅從行為學上初步證實阿米洛利對大鼠骨癌痛的治療作用，其具體下游胞內(nèi)信號通路和分子機制尚有待進一步探討。

綜上所述，局部注射阿米洛利可以有效緩解大鼠脛骨癌痛，為臨床骨癌痛的治療提供新思路和理論依據(jù)。

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Pain relief effect of amiloride regional injection in rat model of tibial bone cancer

Bone neoplasms Pain Amiloride

2012-12-13）

（本文編輯：嚴瑋雯）

313000 湖州市中心醫(yī)院麻醉科（胡四平、汪衛(wèi)星、劉洋、吳鶴芬、余亮），中心實驗室（王翔）；徐州醫(yī)學院江蘇省麻醉學重點實驗室（劉鶴）

胡四平，E-mail：hsp0526@163.com

【 Abstract】Objective To assess the pain relief effect of amiloride regional injection in a rat model of tibial bone cancer pain．Methods Thirty-two female SD rats were randomly divided into 4 groups(n=8 in each group):Cont group,Sham group, bone cancer pain group(BCP group),bone cancer pain and amiloride group(A group)．Fibial bone cancer pain was induced by injection of breast cancer Walker-256 cells into marrow cavity of upper tibia bone in BCP and A groups,amiloride(A group)or normal saline(BCP group)were injected around upper tibia bone at d7 after the model induced．Rats in Sham group were injected with Hank solution into marrow cavity of upper tibia bone,and normal saline around upper tibia bone at the same time points．The mechanical withdrawal threshold(MWT)was measured at d1 before(T0)and d7 after injection(T1)of Walker-256 cells or Hank's solution;30 min(T2)and 1(T3),2(T4),4(T5)and 8h(T6)after injection of amiloride or normal saline．Results Compared to the baseline,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to control group,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to BCP group,MWT was significantly increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased at time points T2～T5in A group;compared with T1,MWT was increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased in A group at time points T2～T5． Conclusion Regional injection of amiloride can reduce mechanical allodynia in a rat model of tibial bone cancer pain．