肝損傷活性研究

徐士勛 王咪娜 林錦旋 程亞濤 王艷慧 緒擴 張宇忠 雷海民

目前酒精濫用已經成為世界性的危害，長期大量飲酒對肝臟有直接毒害作用，從而引發(fā)酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)。在中國ALD發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經嚴重威脅了人民健康[1]，酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[2]。

近年來中醫(yī)中藥防治酒精性肝病的臨床和實驗研究已有報道[3]，鱉甲作為一味常用的保肝、護肝良藥[4-6]，本課題組從醋炙鱉甲中分離獲得寡肽I-C-F-6，通過藥理研究證實該物質對CCl4誘導的急性肝損傷具有防護作用，初步推斷其機理可能與提升肝臟內抗氧化酶谷胱甘肽還原酶及谷胱甘肽過氧化物酶與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性有關[7-8]。臨床和實驗研究報道，鱉甲對酒精引起的肝病也具有一定臨床應用[9-10]，因此本實驗探討了其對小鼠急性酒精性肝損傷的作用。

本實驗采用預先注射給藥30天后以60%酒精灌胃3次誘導建立小鼠急性肝損傷模型，考察各實驗組血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)酶含量及肝臟SOD活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及肝組織病理學檢查，觀察并分析評價鱉甲寡肽化合物I-C-F-6防治酒精致小鼠急性肝損傷效果，深入研究了該化合物的肝保護作用，為寡肽I-C-F-6用于臨床防治酒精性肝病提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性ICR小鼠18～20 g，北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物和試劑

鱉甲寡肽I-C-F-6(序列：GAGPHGG，純度大于98%)，實驗室從醋炙鱉甲中分離純化確證結構，委托上海科肽生物科技有限公司合成。乙醇，生理鹽水，雙蒸水。ALT試劑盒、AST試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，其它試劑均為國產分析純，均購自北京化工廠。

1.3 儀器

萬分之一分析天平(上海分析儀器廠)；TDL-5-A CENTRZFUGE 高速離心機(飛鴿牌)；DK-98-I 型恒溫水浴鍋；注射器(常州悅康醫(yī)療器械有限公司)；RM2015 組織切片機( Leicainstruments Ltd. )；Nikon ECLIPSE90i顯微鏡。

1.4 動物分組

雄性ICR小鼠48只,體重(18±2) g，隨機分為5組：正常對照組8只，模型組10只，寡肽低劑量、寡肽高劑量組各10只，陽性藥組10只，實驗過程中無動物死亡。

1.5 給藥與造模

動物適應飼養(yǎng)1周后，正常對照組和模型組均按0.12 ml·kg-1劑量皮下注射生理鹽水，每天1次；寡肽低劑量組和寡肽高劑量組分別以0.32 mg·kg-1和0.64 mg·kg-1濃度，按0.12 ml·kg-1劑量皮下注射寡肽的生理鹽水溶液；陽性藥組以240.00 mg·kg-1濃度按0.12 ml·kg-1劑量灌胃還原型谷胱甘肽，連續(xù)30天。30天后，除正常對照組以0.12 ml·kg-1劑量灌胃生理鹽水外，其余組均以0.12 ml·kg-1劑量灌胃60%乙醇3次(10小時/次)。

1.6 取材

第30天給藥結束后，連續(xù)3次灌胃60%酒精后(10小時/次)，最后一次禁食不禁水12小時，小鼠摘取眼球取血后，分離血清，-20 ℃保存待檢；小鼠取血處死后，打開腹腔，觀察肝臟色質形態(tài)等情況，從肝右葉切取1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小肝組織一塊做蘇木精—伊紅染色，取肝左葉1.0 g，制備10%的肝勻漿待檢。

1.7 觀測指標

小鼠行為學狀態(tài)：小鼠飲食量、毛發(fā)光澤、體重、糞便狀態(tài)、醉酒狀態(tài)。

小鼠肝體指數：稱量小鼠體重及肝重，記錄后以肝臟質量除以體重，得到小鼠的肝體指數。

血清ALT、AST測定：按試劑盒說明書步驟操作檢測血清ALT，AST活性。

肝組織MDA、SOD的測定：按試劑盒說明書步驟操作檢測肝臟MDA, SOD水平。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠體重及外觀行為變化

模型組小鼠毛質粗糙，厭食，精神萎靡，動作遲緩，體重明顯減輕，解剖肝臟花斑樣改變，蒼白、質硬，有的有腹腔積液；給藥組有所改善。實驗過程中，模型組小鼠無死亡現象。

2.2 小鼠血清ALT、AST比較

與正常對照組相比，模型組血清ALT、AST的活性含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，寡肽組和陽性藥組血清ALT、AST含量明顯降低(P<0.05)；與寡肽組相比，陽性藥組血清ALT、AST的含量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 寡肽I-C-F-6對酒精所致急性肝損

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與模型組相比，cP<0.05。

2.3 小鼠肝臟肝體指數、SOD、MDA比較

與正常對照組相比，模型組肝勻漿SOD活力顯著降低、MDA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組

相比，寡肽組和陽性藥組肝勻漿SOD活力顯著升高、MDA含量明顯降低(P<0.05)；與寡肽組相比，陽性藥組肝勻漿SOD活力顯著升高、MDA含量明顯降低(P<0.05)；見表2。

2.4 小鼠肝組織病理學檢查

HE染色后，電鏡下觀察，正常對照組對照肝細胞核深染，胞漿較大，胞質均勻(A)。模型組肝細胞中央靜脈周圍存在碎片狀肝細胞壞死，部分肝細胞核溶解消失，有充血現象(B)。寡肽低劑量組肝細胞水腫范圍較大，出現肝細胞空泡(C)。寡肽高劑量組肝細胞水腫較輕(D)。陽性藥組肝部分肝細胞侵潤，肝細胞正常范圍多(E)。見圖1。

A

B

C

D

EA 正常對照組；B 模型組；C 寡肽低劑量組(0.32 mg·kg-1)；D 寡肽高劑量組(0.64 mg·kg-1)；E 陽性藥組(240 mg·kg-1)圖1 小鼠肝組織病理學檢查(HE染色 ×400)

組別n給藥濃度(mg·kg-1)SOD(U·ml-1)MDA(nmol·ml-1)肝體指數正常對照組8-60.44±5.441.82±0.290.050±0.0033模型組10-45.37±8.55a4.54±1.48a0.059±0.0034寡肽低劑量組100.3257.59±2.58b2.05±0.35b0.052±0.0038寡肽高劑量組100.6454.94±3.55b1.91±0.58b0.050±0.0037陽性藥組10240.00 58.01±14.95c 2.01±0.22c0.049±0.0029

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與模型組相比，cP<0.05。

3 討論

酒精吸收入血后，90%以上主要在肝臟代謝，其肝損傷機制主要有乙醇的直接毒性、乙醇氧化成乙醛導致的化學性損傷、氧應激和脂質過氧化等，可損害肝臟各種細胞器和酶的結構功能[11]。

ALT和AST是用于診斷肝實質損害的主要酶類，是肝損傷的主要指標，當肝細胞被破壞、細胞膜通透性增高及線粒體損傷時，ALT和AST被釋放到血液中，使之明顯升高[12]；自由基引起的氧化損傷被認為是酒精性肝損傷的重要病理機制[13]，它可以激活氧分子產生氧自由基導致肝細胞膜的脂質過氧化[14-15]，其中SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷[16]；MDA是脂質過氧化反應的終產物，它既能反映機體內氧化反應，也能作為機體損傷的損害因子[17]。

還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，能參與體內氧化還原過程，和過氧化物及自由基本結合對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，臨床上常應用于肝臟疾病[18]。

由實驗結果可以發(fā)現模型組的肝體指數最大，可能是酒精對肝組織造成了影響，使肝臟腫脹、膨大，造成了一定的肝損傷；由血清指標及肝臟指標的統計比較可見，模型組小鼠血清指標ALT、AST及肝臟MDA較正常對照組有顯著升高，肝臟SOD活力明顯降低；而給予寡肽藥物的兩個劑量組肝功能指標均有不同程度的改善，其中寡肽高劑量組在對ALT、AST、MDA的抑制作用方面和SOD活力升高方面尤其明顯，陽性藥組則優(yōu)于寡肽組。肝組織HE染色后的形態(tài)學觀察亦說明，寡肽I-C-F-6可改善酒精導致的急性肝損傷；由此說明鱉甲寡肽I-C-F-6對酒精誘導的小鼠急性肝損傷有較好的預防保護作用。

由鱉甲寡肽I-C-F-6可以升高肝臟SOD酶活力和降低MDA含量可以說明其酒精性肝損傷保護機制可能是通過抗自由基及脂質過氧化而實現，但仍需進一步實驗證實。

本實驗所用藥物鱉甲寡肽I-C-F-6是一種由7個L-氨基酸組成的具有全新結構的小肽化合物，其分子量小于1000，與蛋白質相比，小分子肽的抗原性小，不易引起過敏反應，而且還具有很好的溶解性，在體內吸收快、利用率高，因此更有利于發(fā)揮藥效。以上研究表明，鱉甲寡肽化合物I-C-F-6在防治酒精誘導形成的小鼠急性肝損傷方面有著較為顯著作用，具有保護肝細胞作用，為后續(xù)先導化合物的開發(fā)和研究奠定基礎，為后期臨床研究提供一定的參考依據。

[1] 莊輝.酒精性肝病的流行病學[J].中華肝臟病雜志,2003,11(11):689.

[2] 李學鋒,周明歡,向平,等.胰島素抵抗與酒精性肝病血清瘦素水平的關系[J].實用醫(yī)學雜志,2008,24(4):592-593.

[3] 路瑞華,魯慶峰.中醫(yī)藥防治酒精性肝損傷的研究進展[J].黑龍江醫(yī)藥,2004,1(17):38.

[4] 姜宏偉.單味鱉甲治療肝炎肝硬化30例[J].臨床醫(yī)學,2007,27(6):93-94.

[5] 曹鐵栓.通絡化纖湯治療肝纖維化66例[J].陜西中醫(yī),2006,26(9):1071-1073.

[6] 鄺衛(wèi)紅.鱉甲煎湯治療慢性乙型肝炎27例療效觀察[J].山東中醫(yī)雜志,2005,24(11):655-657.

[7] 雷海民.抗乙肝病毒寡肽及其衍生物[P].申請?zhí)?201010187949.9,實質審查的生效.

[8] 張宇忠.鱉甲寡肽化合物I-C-f-6對四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷的保護作用[J].中國病理生理雜志,2010,26(10):2074.

[9] 郝彥開,楊玉巧,賈軍峰,等.化肝湯1號對中老年酒精性肝纖維化患者TGF-β1的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(20):3916-3917.

[10] 黃文豹.復方鱉甲軟肝片治療酒精性肝硬化療效觀察[J].浙江中西醫(yī)結合雜志,2007,17(2):93-94.

[11] 厲有名.酒精性肝病的發(fā)病機制[J].中華肝臟病雜志,2003,11(11):690-691.

[12] Kew MC.Serum aminotransferase concentration as evidence of hepatocellular damage [J].Lancet 2000,355(9204):591-592.

[13] Kaplowitz N.Mechanisms of liver cell injury[J].J Hepatol,2000,32(1 Suppl):39-47.

[14] MullerA,Sies H.Inhibition of ethanol-and aldehyde-induced release of ethane from isolated perfused rat liver by Pargyline and disulfiram[J].Pharmacol Biochem Behav,1983,18(6):429.

[15] Strubelt O,Younes M,Pentz R.Enhancement by glutathione Depletion of ethanol-induced acute hepatotoxicity in vitro and in vivo[J].Toxicology,1987,45(2):213.

[16] 方允中,李文杰.自由基與酶(基礎理論及其在生物學和醫(yī)學中的應用)[M].北京:科學出版社,1999:200-205.

[17] Masalkar PD,Abhang SA.Oxidative stress and antioxidant status in patients with alcoholic liver disease[J].Clin ChimActa,2005,355(1-2):61-65.

[18] 袁平戈,張大志.還原型谷胱甘肽的作用機制及臨床應用[J].藥品評價,2006,3(5):385-390.