多發(fā)性硬化實(shí)驗(yàn)動物模型研究進(jìn)展

陳永妍，李 林，張 旗，尹琳琳*

(1．首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室北京市老年病醫(yī)療研究中心神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2．鄭州大學(xué) 藥學(xué)院，河南鄭州450001)

多發(fā)性硬化 (multiple sclerosis，MS)屬中樞神經(jīng)系統(tǒng) (central nervous system，CNS)炎性反應(yīng)脫髓鞘疾病，是CNS脫髓鞘疾病的典型代表［1-2］。目前多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制尚不明確，較為公認(rèn)的學(xué)說是病原體侵入機(jī)體引發(fā)異常的自身免疫反應(yīng)所致［3］。由于神經(jīng)組織取樣的局限性，為了獲得疾病不同方面的信息，采用動物模型模擬MS的病理改變和臨床特征是十分必需和必要的。

1 髓鞘多肽片段誘導(dǎo)的MS動物模型

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimentally allergic encephalomyelitis，EAE)是一種以特異性致敏的CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫疾病，是人類多發(fā)性硬化經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動物模型［4］。致腦炎物質(zhì)能夠誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(experimentally allergic encephalomyelitis，EAE)［5］，這些物質(zhì)主要包括髓鞘堿性蛋白(myelin basic protei，MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein，PLP)、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycop rotein，MOG)或合成的能夠替代上述蛋白的多肽序列。髓鞘多肽片段誘發(fā)EAE的機(jī)制相似:即致腦炎物質(zhì)被T細(xì)胞識別，髓鞘蛋白反應(yīng)性CD4+Th1細(xì)胞活性增高，免疫細(xì)胞進(jìn)入CNS，導(dǎo)致炎性反應(yīng)和脫髓鞘。不同的髓鞘抗原誘導(dǎo)不同品系的動物，產(chǎn)生針對不同抗原的特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞，可建立模擬不同MS亞型的 EAE 模型［4，6］。

致腦炎物質(zhì)在誘導(dǎo)動物模型時(shí)通常需要輔助物質(zhì)如弗氏佐劑活化免疫反應(yīng)。造模常用方法有腳墊、頸部及背部 (皮下、皮內(nèi)、肌肉)、腹腔和尾靜脈注射等，以皮下多點(diǎn)注射及腳墊注射的發(fā)病率最高，頸部注射則有較高的復(fù)發(fā)率。多種品系動物均可誘發(fā)MS，但由于壽命、繁殖能力及與人類MS的相似性等多種因素，最常用的動物是大鼠和小鼠。

1.1 MBP誘導(dǎo)的EAE模型

MBP是髓鞘的主要成分之一，是一種由少突膠質(zhì)細(xì)胞和施旺細(xì)胞合成分泌的髓鞘中抗原性最強(qiáng)的堿性蛋白。研究表明，MBP可激活體內(nèi)Th+細(xì)胞，使之透過血腦屏障，攻擊自身神經(jīng)髓鞘的MBP，導(dǎo)致CNS脫髓鞘。MBP誘發(fā)的EAE為單相病程，沒有復(fù)發(fā)緩解，但炎性反應(yīng)明顯，脫髓鞘輕微。一般使用雌性Lewis大鼠造模，常用于MS急性發(fā)作和緩解期的研究。鞘堿性蛋白(myelin basic protei，MBP)與蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein，PLP)、髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycop rotein，MOG)相比，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛(在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)均有)［7］。MBP在大鼠、小鼠、豚鼠和靈長類均可誘發(fā) EAE。與嚙齒類和靈長類誘發(fā)的EAE相似，人類的MBP特異性免疫反應(yīng)在致病性表位和Ⅱ類MHC限制性方面與它們均有明顯的相似性。

1.2 PLP誘導(dǎo)的EAE模型

PLP是最豐富的中樞神經(jīng)髓鞘蛋白，長期以來MBP和PLP被認(rèn)為是誘發(fā)EAE或MS的主要抗原。PLP誘發(fā)的EAE多為復(fù)發(fā)-緩解型，常選用雌性SJL(SJL/JOrllcoCrlVr)小鼠造模，表現(xiàn)為多次的復(fù)發(fā)緩解，程度相對較輕，可觀察到人類MS的所有病理改變，接近于緩解復(fù)發(fā)型MS，與MBP相比，PLP是更強(qiáng)的致病性抗原。采用脊髓勻漿致敏動物誘發(fā)的EAE主要針對PLP，臨床多次復(fù)發(fā)后發(fā)生的表位擴(kuò)展首先針對 PLP，然后才針對MBP。

1.3 MOG誘導(dǎo)的EAE模型

MOG是一種只存在于髓鞘膜和髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞表面的糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，只占髓鞘總蛋白的0．01% ～0．05%，具有免疫源性高、可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗 MOG T淋巴細(xì)胞等特點(diǎn)［8］。MOG可誘發(fā)復(fù)發(fā)-非緩解型EAE模型，其機(jī)制與MS的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)相關(guān)。C57/BL6小鼠是最常用的動物，造模時(shí)無性別差異，產(chǎn)生慢性非復(fù)發(fā)型EAE。部分MOG轉(zhuǎn)基因小鼠可自發(fā)發(fā)生炎性反應(yīng)、脫髓鞘和軸索損害，35%可自發(fā)發(fā)生視神經(jīng)炎。

不同的髓鞘蛋白誘發(fā)病灶部位、自身抗體或反應(yīng)性T細(xì)胞不同的EAE動物模型以模擬不同亞型的MS。

2 病毒誘導(dǎo)的動物模型

研究發(fā)現(xiàn)多種動物攜帶的病毒可通過感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)而誘發(fā)MS動物模型，例如冰島羊攜帶的Visna病毒，山羊攜帶的山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒，小鼠攜帶的Semliki Forest病毒等。雖然它們均屬于RNA病毒，但病毒序列不具有任何相似性。該類模型在國內(nèi)使用較少。目前認(rèn)為病毒誘發(fā)腦脊髓炎的機(jī)制主要是病毒侵入機(jī)體后受到T淋巴細(xì)胞攻擊而產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，或病毒直接攻擊少突膠質(zhì)細(xì)胞從而導(dǎo)致髓鞘脫失［9］所致。

2.1 小鼠Theiler's腦脊髓炎病毒模型

小鼠Theiler's腦脊髓炎病毒(Theiler's encephalomyelitis virus，TMEV)是心臟病毒屬中的單鏈RNA病毒［10］。TMEV模型沒有復(fù)發(fā)現(xiàn)象，通常在首次接種數(shù)月后才表現(xiàn)出行為癥狀，與EAE模型造模后數(shù)周即出現(xiàn)行為學(xué)障礙相比更接近臨床，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)其他指標(biāo)與人類均十分相似，主要用于模擬慢性-漸進(jìn)型多發(fā)性硬化、研究病毒感染后自身免疫反應(yīng)的形成機(jī)制等。

2.2 小鼠肝炎病毒模型

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)是一種正鏈RNA病毒，主要存在于血液和內(nèi)臟中［11］。MHV模型常用于模擬復(fù)發(fā)-緩解型MS。

2.3 其他病毒誘導(dǎo)的動物模型

此外，犬瘟熱病毒、麻疹類病毒、皰疹病毒以及朊病毒等都可誘發(fā)多種動物脫髓鞘。近年來研究發(fā)現(xiàn)人類皰疹病毒6型和EB(Epstein-Barr virus，EB)病毒也與MS發(fā)病相關(guān)［9］，此外，反轉(zhuǎn)錄病毒如綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒和山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒感染也可引起動物脫髓鞘、炎性反應(yīng)。

3 其他動物模型

除上述動物模型外，還有化學(xué)毒素誘發(fā)的脫髓鞘動物模型，以Cuprizone模型最為常用。

Cuprizone模型是由神經(jīng)毒素Cupizone(雙環(huán)己酮草酰二腙)誘發(fā)的脫髓鞘模型，病理特征主要是髓鞘脫失，無T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。Cuprizone是一種銅離子螯合劑，因Cuprizone具有獨(dú)特的神經(jīng)毒性而用于CNS的研究。Cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘機(jī)制主要由于其可特異性誘導(dǎo)髓鞘形成細(xì)胞——少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡所致［12］，推測可能是由于Cuprizone螯合銅離子后導(dǎo)致銅離子所依賴的一系列酶如線粒體酶、細(xì)胞色素氧化酶以及單胺氧化酶等被抑制所致。Cuprizone可誘發(fā)急性和慢性脫髓鞘，慢性脫髓鞘后，髓鞘很難再生［13］。它可以在時(shí)間和空間上控制髓鞘的脫失和再生，但受動物性別、年齡的影響，多采用6～9周齡C57/BL6小鼠喂食含0．2% ～0．3%Cuprizone的飼料制備Cuprizone模型。該模型主要用于CNS相關(guān)的髓鞘脫失和髓鞘再生機(jī)制的研究及作為評價(jià)精神分裂癥的輔助模型［14-15］。

溶血卵磷脂損傷髓鞘細(xì)胞的機(jī)制是其促進(jìn)活化的巨噬細(xì)胞表達(dá)磷脂酶A2，后者可將膜磷酸卵磷酯降解為溶血卵磷脂，誘導(dǎo)髓鞘降解［16］。溶血卵磷脂多用于嚙齒類動物模型，用于髓鞘脫失和髓鞘再生機(jī)制的研究。

溴化乙錠(ethidium bromide)通過侵入少突膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)破壞其結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生空泡樣病變，少突膠質(zhì)細(xì)胞碎片被大量巨噬細(xì)胞吞噬并最終導(dǎo)致脫髓鞘。溴化乙錠使神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘現(xiàn)象最早是Yajima發(fā)現(xiàn)并采用的［17］。溴化乙錠模型可造成原發(fā)性的髓鞘損傷，且損傷面積較大、定位準(zhǔn)確、脫髓鞘病理改變均與MS相似［18-19］，還具有損傷可控、不受動物年齡、性別影響等優(yōu)點(diǎn)。

化學(xué)毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型與EAE模型、病毒模型相比，病程相對簡單，無炎性反應(yīng)現(xiàn)象，且病程可控。

4 MS實(shí)驗(yàn)動物模型的應(yīng)用與意義

MS實(shí)驗(yàn)動物模型的作用在于幫助人們研究和預(yù)測疾病并探索相應(yīng)的治療方法。理想的MS實(shí)驗(yàn)動物模型能夠模擬人類MS的發(fā)病，或與人類MS極為相似?？v觀各種MS實(shí)驗(yàn)動物模型，沒有任何一種動物自發(fā)出現(xiàn)MS，也沒有任何一種動物模型可以模擬出MS的所有特征，僅能從某一側(cè)面反映出疾病在某一階段或某一方面的病理改變。盡管MS動物模型存在缺陷，但它仍然是研究MS最有效的工具。MS動物模型將繼續(xù)為人類攻克MS提供有效信息，但是從動物模型中獲得的研究結(jié)果仍需謹(jǐn)慎用于臨床。

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