鈣網(wǎng)蛋白與腫瘤治療

高樹(shù)峰，徐 蓮 ，張少容，李 黎 ，汪美群，劉月輝

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江西南昌330006)

鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)為主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)且高度保守的一種Ca2+結(jié)合蛋白，包括協(xié)助蛋白質(zhì)加工折疊、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣平衡、抑制腫瘤血管新生和參與抗原遞呈及細(xì)胞凋亡等功能。最近發(fā)現(xiàn)，CRT在臨床腫瘤的治療方面有著不可估計(jì)的應(yīng)用前景，成為研究熱點(diǎn)之一。

1 CRT的生物學(xué)特性

1.1 CRT結(jié)構(gòu)

CRT為生物體內(nèi)高度保守、長(zhǎng)約3.6 kb，分子質(zhì)量46.5 ku、由單基因編碼的可溶性Ca2+綁定伴侶蛋白，屬熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)。人CRT基因位于第19號(hào)染色體p13.3～p13.2區(qū)段，由8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成，分別包含于疏水的17肽信號(hào)順序和3個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)端:高度保守近似球形結(jié)構(gòu)的N端、參與ER內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存呈酸性的C端和中間富含脯氨酸成“延長(zhǎng)的臂膀”式結(jié)構(gòu)的 P 端［1］。

1.2 CRT分布及功能

CRT在多種腫瘤發(fā)現(xiàn)表達(dá)，如白血病、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌和肝癌等［2－3］。CRT主要存在于ER，還存在于胞膜、胞質(zhì)或胞外基質(zhì)等所謂的非ER-CRT，非ER-CRT可能成為自身抗原，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)病源［4］。最初認(rèn)為CRT主要調(diào)節(jié)Ca2+平衡，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其參與新生蛋白的加工、低聚糖的降解、抗原提呈且在細(xì)胞凋亡和抑制血管生成中也發(fā)揮重要作用［5］。其次，在綁定Ca2+調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣、增加 ER-Ca2+的蓄存、調(diào)整ER-Ca2+-ATP酶功能、控制細(xì)胞黏連和類(lèi)固醇敏感性基因表達(dá)起重要作用［6］。再次，CRT還參與“ER質(zhì)量監(jiān)控”，阻止不正確折疊表達(dá)和未完整合成人類(lèi)組織相容性抗原-I(HLA-I)的分泌及聚集，CRT穩(wěn)定完整的表達(dá)可促進(jìn)某些腫瘤的免疫原性凋亡［4，7］。此外，CRT 還在抑制體內(nèi)補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活、參與生殖細(xì)胞和心血管系統(tǒng)的早期發(fā)育方面起到密切作用［8］。

1.3 CRT調(diào)節(jié)機(jī)制

CRT可增加胞內(nèi)Ca2+通過(guò)ER的流動(dòng)，同時(shí)降低線粒體Ca2+的濃度并降低膜電位，因此，Ca2+在ER和線粒體間的周轉(zhuǎn)增加可能會(huì)損壞線粒體，此可使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)刺激的感受性增強(qiáng)。另外CRT過(guò)表達(dá)的腫瘤對(duì)放、化療誘發(fā)的細(xì)胞凋亡更敏感，還可通過(guò)改變Ca2+穩(wěn)態(tài)、阻止Akt信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)P53功能，以調(diào)整其誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，凋亡細(xì)胞表面的CRT還能被樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)識(shí)別，促進(jìn)凋亡細(xì)胞被清除，參與抗原提呈和活化特異性免疫應(yīng)答［4］。近年來(lái)研究表明CRT從ER移位到胞膜是凋亡細(xì)胞免疫原性的重要標(biāo)志，決定特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生［9～13］。蒽環(huán)類(lèi)藥物亦能快速誘導(dǎo)HSP90和HSP70的膜外翻以及HMGB-1的釋放，通過(guò)TLR4受體HMGB-I可促進(jìn)凋亡細(xì)胞向DCs提呈，經(jīng)藥物處理的腫瘤細(xì)胞能激活DCs并增強(qiáng)吞噬，而此后的DCs可激活釋放γ-IFN的特異性CD4+、CD8+CTL，并誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生［14－15］。

1.4 CRT與凋亡細(xì)胞的清除

凋亡細(xì)胞的清除是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本生理過(guò)程，主要靠吞噬細(xì)胞的有效識(shí)別和吞噬。而CRT、HMGB-l、HSP等特征性的蛋白分子可激發(fā)體內(nèi)免疫細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的有效識(shí)別與攻擊，所以作為特異性識(shí)別信號(hào)的CRT對(duì)凋亡細(xì)胞的有效識(shí)別及清除起關(guān)鍵作用，是吞噬過(guò)程中的重要膜配體分子。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，CRT會(huì)發(fā)生簇集，成為被吞噬細(xì)胞表面的清道夫受體LDL相關(guān)蛋白所能識(shí)別的與Ps、C1q形成的“來(lái)吃我”信號(hào)識(shí)別復(fù)合體，從而啟動(dòng)清除、吞噬的過(guò)程［4，16］。結(jié)腸癌細(xì)胞CT26用蒽環(huán)類(lèi)藥物處理后:胞膜表面CRT呈高表達(dá)并團(tuán)狀聚集，而特征性的凋亡細(xì)胞表現(xiàn)PS外翻在用藥數(shù)小時(shí)后才會(huì)出現(xiàn)。同時(shí)，可快速誘導(dǎo)CRT膜轉(zhuǎn)位，促使凋亡細(xì)胞被DCs等識(shí)別并呈遞給CD4+和CD8+CTL，從而激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答［9］。

1.5 CRT與腫瘤免疫原性

CRT的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡，利于殘瘤清除，這為抗腫瘤治療提供了一種有效的免疫靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在凋亡早期胞膜表面的CRT改變可引起有效識(shí)別、攻擊腫瘤的免疫原效應(yīng)［5］。而增強(qiáng)CRT表達(dá)的蛋白磷酸酶GADD34抑制劑或重組CRT與絲裂霉素C和依托泊苷等聯(lián)合使用，可把非免疫原性的腫瘤細(xì)胞死亡轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)為免疫原性死亡［9］。雖然不同的化療藥物能通過(guò)相同的細(xì)胞凋亡方式來(lái)殺死腫瘤，但激活免疫力的能力卻不盡相同，ER-CRT移位到胞膜表面是DCs識(shí)別和吞噬壞死腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵過(guò)程，葸環(huán)類(lèi)藥物和γ射線可誘導(dǎo)CRT移位，因此，消除CRT的存在也消除了葸環(huán)類(lèi)藥物誘導(dǎo)的免疫原性，即誘導(dǎo)CRT移位的藥物或外源性CRT均可加強(qiáng)凋亡細(xì)胞的免疫原性［17］。另CRT本身具有較強(qiáng)的免疫佐劑功能，胞膜上的多糖分子能與CRT相互結(jié)合，此可促進(jìn)B細(xì)胞活化與成熟，致相應(yīng)抗體的產(chǎn)生［18］。

2 CRT的臨床應(yīng)用研究

2.1 CRT與機(jī)體致瘤

在腫瘤轉(zhuǎn)化形成中多種抗原同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生，為阻止腫瘤形成，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)啟動(dòng)針對(duì)新抗原的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞。研究指出:由CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機(jī)體腫瘤排斥方面起重要作用，但腫瘤抗原并不能被CTL完整識(shí)別，抗原肽MHC-I分子復(fù)合體才被有效識(shí)別，而在ER中腫瘤抗原被降解加工成短肽并與裝載到MHC-I分子復(fù)合體的肽結(jié)合后一起被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面供CTL識(shí)別。細(xì)胞系(K42)CRT-其抗原肽正確裝載下降50% ～80%，并影響CTL對(duì)2/3抗原肽的有效識(shí)別，而轉(zhuǎn)染CRT基因后則能恢復(fù)上述功能的正?；?9］。CRT N端序列能抑制血管生成、內(nèi)皮增生和腫瘤形成。除此，把從AML和膀胱癌患者中提取的CRT+腫瘤細(xì)胞種植于裸鼠與種植CRT－形成的腫瘤對(duì)比，顯示CRT+組有功能性活力和致瘤潛能［2］。

2.2 CRT與腫瘤的診斷及預(yù)后

不能早期診斷而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)是腫瘤患者死亡率高的一個(gè)重要原因，追其根源就是早期缺乏敏感性強(qiáng)、特異性高的腫瘤標(biāo)記物，所以尋找利于腫瘤早期診斷的標(biāo)記物至為關(guān)鍵，而多種瘤中CRT及其裂解片段較正常組織有明顯量的改變，提示其可能成為合適的新腫瘤標(biāo)記物。膀胱癌的研究中通過(guò)檢測(cè)尿中CRT發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量也明顯增加，考慮是否將CRT作為潛在生物學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于早期診斷［3］。另外，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和結(jié)腸癌中CRT的高表達(dá)直接關(guān)系到腫瘤的進(jìn)展，尤其表現(xiàn)在高度惡性和低分化區(qū)域，表明CRT與腫瘤的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有直接關(guān)系［20］。

2.3 CRT與腫瘤的基因治療

CRT與腫瘤的演化密切關(guān)聯(lián)，與腫瘤特異性抗原形成的CRT識(shí)別復(fù)合體被DCs識(shí)別和吞噬能提高M(jìn)HC-I類(lèi)分子的折疊處理及抗原提呈能力，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生、活化特異性CD8+CTL并形成適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答。牛痘疫苗是特異性抗原免疫治療的重要載體，將CRT與HPV16型E7、牛痘疫苗相連組成Vac-CRT-E7融合疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，示融合疫苗組產(chǎn)生的特異CD8+CTL較單獨(dú)使用腫瘤特異性抗原肽或CRT免疫產(chǎn)生的效果更明顯，實(shí)驗(yàn)組 E7特異IL-2及TNF-γ干擾素分泌性 CD8+CTL激活比例增多，并對(duì)表達(dá)E7的腫瘤產(chǎn)生顯著抗瘤效應(yīng)，提示此融合疫苗可作為腫瘤基因治療研發(fā)的新策略［21－22］。將CRT與胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)基因重組，再轉(zhuǎn)染至鼠黑素瘤細(xì)胞表達(dá)出CRT-GPCRs融合蛋白，觀察到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出很強(qiáng)的抗同種瘤的抗原呈遞殺傷效應(yīng)，提示此重組細(xì)胞具備用于高級(jí)哺乳動(dòng)物腫瘤疫苗的潛在實(shí)用價(jià)值［10］。另用CRT-E7融合基因的腺病毒攜帶載體和含E7-CRT的基因疫苗免疫小鼠，荷瘤小鼠不但產(chǎn)生了明顯的抗瘤效應(yīng)，且誘導(dǎo)并強(qiáng)化了免疫記憶細(xì)胞，為腫瘤治療性疫苗的研究邁出了關(guān)鍵一步［21］。

2.4 CRT與腫瘤的放療

神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4細(xì)胞中的CRT表達(dá)高于成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U25lMG和T98G)，其對(duì)γ射線的敏感性顯示前者遠(yuǎn)高于后者;同時(shí)，將CRT基因?qū)氲捅磉_(dá)CRT的U251MG并檢測(cè)CRT過(guò)表達(dá)，同樣放射當(dāng)量下，導(dǎo)入CRT基因組輻射誘導(dǎo)的凋亡明顯高于未轉(zhuǎn)染組，并導(dǎo)致Ca2+依賴性的Akt脫磷酸與失活的蛋白磷酸酶2Aca表達(dá)的上調(diào)，Akt途徑的細(xì)胞存活信號(hào)在此過(guò)程中受到明顯抑制，最終增強(qiáng)放射誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用，證實(shí)了CRT可提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放射的敏感性，這為易產(chǎn)生耐受且對(duì)放療敏感的惡性腫瘤治療提供了另一條路徑。但基礎(chǔ)研究中其他腫瘤放療敏感耐受性實(shí)驗(yàn)探究尚有待陸續(xù)展開(kāi)［22］。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，CRT在腫瘤綜合診治方面有著廣闊的應(yīng)用前景:在腫瘤胞膜的表達(dá)能促進(jìn)其免疫原性凋亡，利于殘瘤清除，通過(guò)與自身抗原復(fù)合物結(jié)合抑制補(bǔ)體激活和協(xié)助抗體入胞等，為疾病提供了有效的免疫治療靶點(diǎn);近年證實(shí)CRT還可增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療的敏感性，為腫瘤的基因治療和放療提供了新策略;因多種腫瘤CRT表達(dá)較正常細(xì)胞有明顯改變，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切關(guān)連，有望在腫瘤早期診斷及預(yù)后判斷方面發(fā)揮作用。但是，CRT單獨(dú)或聯(lián)合其他基因的綜合治療性實(shí)驗(yàn)研究還有待進(jìn)一步證實(shí);另外，CRT的實(shí)驗(yàn)研究成果要真正應(yīng)用臨床還有待可行性臨床試驗(yàn)證實(shí)，此已成為領(lǐng)域內(nèi)研究熱點(diǎn)，有望成為臨床腫瘤綜合治療中的一道新曙光。

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