雙歧桿菌對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)展

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

雙歧桿菌是存在于人類(lèi)和動(dòng)物腸道菌群中的一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。該細(xì)菌是人類(lèi)的主要益生菌種屬之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、維持腸道正常菌群平衡、改善小腸結(jié)構(gòu)、潤(rùn)腸通便及延緩衰老等益生功能。因此，近幾年來(lái)與雙歧桿菌及其促生長(zhǎng)因子有關(guān)的食品引起越來(lái)越多的關(guān)注[1]。

在生產(chǎn)加工、消化吸收的過(guò)程中，雙歧桿菌面臨著多種脅迫環(huán)境。首先，雙歧桿菌必須抵御工業(yè)生產(chǎn)中遇到的熱激、低水分活度、高滲及氧等各種脅迫；其次，雙歧桿菌進(jìn)入消化系統(tǒng)后，需要抵御胃部的酸性環(huán)境和小腸的高濃度膽鹽等脅迫，才能以足夠量的活菌數(shù)到達(dá)結(jié)腸發(fā)揮益生功能[2]。因此，對(duì)脅迫耐受力強(qiáng)的菌株將有更廣闊的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

根據(jù)已有報(bào)道，目前提高益生菌脅迫耐受性主要有兩種方法：一種方法是將益生菌在亞致死條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生脅迫耐受應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)其脅迫耐受力，提高其在致死脅迫條件下存活率[3～6]；另一種方法是從脅迫環(huán)境中篩選出脅迫耐受力強(qiáng)的菌株[7～10]。最近的研究表明，在脅迫條件下篩選出來(lái)的益生菌菌株能夠適應(yīng)生產(chǎn)加工中存在的脅迫環(huán)境[11]。這兩種提高益生菌脅迫耐受性方法的實(shí)質(zhì)是通過(guò)誘導(dǎo)或篩選使益生菌的脅迫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)，因此研究雙歧桿菌的脅迫應(yīng)答機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)高脅迫耐受性的雙歧桿菌具有重要意義。

近些年來(lái)，有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)等方法研究了益生菌的脅迫應(yīng)答分子機(jī)制[5，12～14]，并且鑒定出一些與脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因[15～16]。本文根據(jù)已有研究報(bào)道，對(duì)雙歧桿菌在生產(chǎn)加工及人體胃腸道中的脅迫應(yīng)答作了簡(jiǎn)要綜述。

1 雙歧桿菌對(duì)生產(chǎn)加工過(guò)程中脅迫的應(yīng)答

噴霧干燥是含有益生菌產(chǎn)品加工過(guò)程中常用工藝，這會(huì)使細(xì)菌暴露于高溫而且有氧的環(huán)境下[17～18]，對(duì)益生菌的氧、熱脅迫耐受性造成了極大的挑戰(zhàn)。另外，當(dāng)含有益生菌產(chǎn)品基質(zhì)中有其它微生物存在時(shí)，又會(huì)對(duì)益生菌的生存造成競(jìng)爭(zhēng)脅迫。首先針對(duì)雙歧桿菌在氧脅迫、高溫脅迫及競(jìng)爭(zhēng)脅迫下的應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)行綜述。

1.1 氧脅迫

雙歧桿菌屬于厭氧菌，對(duì)氧氣敏感。在氧氣存在時(shí)，細(xì)菌胞內(nèi)會(huì)形成等活性氧，而雙歧桿菌缺少有效的活性氧清除機(jī)制，使活性氧在細(xì)胞內(nèi)積累，進(jìn)而造成DNA及蛋白質(zhì)等分子的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。然而不同的雙歧桿菌菌株對(duì)氧的敏感性有差異。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的菌株間耐氧性差異的研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的耐氧機(jī)制包括如下幾方面。

首先，雙歧桿菌的耐氧機(jī)制與NADH氧化酶和NADH過(guò)氧化物酶有關(guān)系。該酶在乳酸菌中參與如下反應(yīng)[20～21]：

乳酸菌通過(guò)兩個(gè)途徑將O2轉(zhuǎn)化成無(wú)毒的H2O，途徑一：通過(guò)反應(yīng)3，直接將O2轉(zhuǎn)化成H2O；途徑二：先經(jīng)過(guò)反應(yīng)2，將O2轉(zhuǎn)化成H2O2，再經(jīng)過(guò)反應(yīng)4，將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O。NADH氧化酶普遍存在于乳酸菌中，乳酸菌的NADH氧化酶主要指NADH-H2O2氧化酶和NADH-H2O氧化酶。只有一些乳酸菌中具有NADH過(guò)氧化物酶[22]。雙歧桿菌通常具有NADH氧化酶和NADH過(guò)氧化物酶活力，由此推想，雙歧桿菌利用這兩種酶、通過(guò)這兩條途徑，進(jìn)行氧脅迫應(yīng)答，提高了耐氧性。

其次，雙歧桿菌的耐氧機(jī)制與SOD（超氧化物歧化酶）有關(guān)系。該酶可將氧化活力較高的O2-轉(zhuǎn)化成活力較低的H2O2，參加如下反應(yīng)：

SOD參與雙歧桿菌的耐氧機(jī)制，主要通過(guò)如下途徑：先經(jīng)過(guò)反應(yīng)1，將O2轉(zhuǎn)化成O2-，再經(jīng)過(guò)反應(yīng)5，將O2-轉(zhuǎn)化成H2O2，最后經(jīng)過(guò)反應(yīng)4，將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O，起到了清除活性氧的作用[19]。

再次，雙歧桿菌的耐氧機(jī)制還與環(huán)丙烷脂肪酸（CFU）有關(guān)。CFU是多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分。細(xì)菌的CFU通常在穩(wěn)定初期，由細(xì)胞膜磷脂上的不飽和脂肪酸（UFA）與S-腺苷甲硫氨酸在環(huán)丙烷脂肪酸合成酶作用下形成[23]。這一反應(yīng)增強(qiáng)了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了細(xì)菌的耐氧性。

有關(guān)雙歧桿菌氧脅迫的機(jī)制還在不斷的研究中。Yilei Qian等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏還原劑-半胱氨酸時(shí)，雙歧桿菌面臨氧脅迫，胞內(nèi)積累的多聚磷酸鹽含量增多，同時(shí)對(duì)酸脅迫的耐受力增強(qiáng)[24]。為了提高雙歧桿菌Bifidobacterium longum 105-A對(duì)氧脅迫的耐受力，Robert Matsul等將Bacillus subtilis過(guò)氧化氫酶基因KatE導(dǎo)入雙歧桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的耐氧能力有所提高[25]。

1.2 熱激

熱激是雙歧桿菌在生產(chǎn)加工中遇到的另一種脅迫，有關(guān)它的研究很多。當(dāng)熱激發(fā)生時(shí)，一些雙歧桿菌如B.longum、Bifidobacterium adolescentis和Bifidobacterium breve中的幾種熱激蛋白，如分子伴侶蛋白（如DnaK）、與DNA和RNA合成及細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加[26]。B.longum NCC2705和B.breve UCC2003的基因序列信息已知，很多學(xué)者將這兩株菌作為熱激應(yīng)答的研究對(duì)象。B.longum NCC2705在熱激處理下（50 ℃下，3，7，12 min）全轉(zhuǎn)錄組分析顯示，有46%的基因表達(dá)量發(fā)生改變[27]。已有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了該菌株中分子伴侶蛋白系統(tǒng)（DnaK，GroEL和HtrA）[28]。菌株NCC2705也通過(guò)誘導(dǎo)smpB基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)熱激脅迫，smpB負(fù)責(zé)編碼與tmRNA相關(guān)的小蛋白B，因此，smpB與tmRNA基因的表達(dá)量同時(shí)上調(diào)[27]。將野生株B.longumNCC2705及其耐熱誘變株NCC2912的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行對(duì)比，分析發(fā)現(xiàn)有19 種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有差異。其中，有些蛋白質(zhì)參與了葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)合成等，另外還有一些蛋白質(zhì)是熱激蛋白[28～29]，如分子伴侶蛋白和蛋白酶，主要是ClpC、ClpA/B、GrpE、DnaK和Fk506結(jié)合蛋白[29]。最近的研究結(jié)果表明，在熱激條件下dnaK操縱子負(fù)責(zé)調(diào)控的hspR基因發(fā)生突變，這種突變影響了hsp結(jié)合到dnaK啟動(dòng)子上的能力，導(dǎo)致DnaK分子伴侶蛋白表達(dá)量上調(diào)[30]。

在B.breve的熱激應(yīng)答中，分子伴侶蛋白發(fā)揮主要的作用。Ventura等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)面對(duì)熱激時(shí)，菌株UCC2003通過(guò)過(guò)量表達(dá)兩組分子伴侶蛋白來(lái)進(jìn)行應(yīng)答。第一組蛋白質(zhì)參與溫和的熱激應(yīng)答，包括GroEL、GroES、ClpC和ClpPs；第二組參與劇烈的熱激應(yīng)答，包括DnaK、GrpE、DnaJ和ClpB[16]。另外，編碼一些小熱激蛋白家族的基因hsp20在熱激后也會(huì)過(guò)量表達(dá)[31]。

1.3 其它微生物的競(jìng)爭(zhēng)

另一個(gè)雙歧桿菌在生產(chǎn)加工中需要面對(duì)的脅迫是食品基質(zhì)中多種微生物的競(jìng)爭(zhēng)。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)及抗菌代謝物（主要是有機(jī)酸）的積累，能夠影響微生物的生長(zhǎng)和功能發(fā)揮。Ruiz等通過(guò)雙向電泳的方法研究發(fā)現(xiàn)，B.longum和B.breve共同培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)相比，有16 種蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變[32]。這些蛋白質(zhì)包括核糖體蛋白和參與碳水化合物代謝、基因調(diào)控、細(xì)胞壁生物合成和運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)。顯然，其它菌及發(fā)酵劑的存在會(huì)影響特定益生菌的生理功能。

2 雙歧桿菌對(duì)胃腸道中脅迫的應(yīng)答

雙歧桿菌為了在人類(lèi)胃腸道中定殖，需要克服酸脅迫、膽鹽脅迫等許多不利環(huán)境，在此過(guò)程中雙歧桿菌啟動(dòng)了一系列脅迫應(yīng)答機(jī)制。

2.1 酸脅迫

口服雙歧桿菌首先要經(jīng)歷的是pH值接近2.0的胃部酸環(huán)境，這將大大減少菌體的存活數(shù)量。通常，除動(dòng)物雙歧桿菌外，雙歧桿菌耐受酸脅迫的能力很差[8，33]。一個(gè)很好的方法是篩選耐酸性強(qiáng)的菌株，因?yàn)樗梢栽鰪?qiáng)對(duì)其它脅迫因素的交互抗性，既包括人類(lèi)胃腸道中的脅迫，也包括工藝生產(chǎn)中的脅迫[7，34]。在雙歧桿菌暴露于亞致死酸環(huán)境后，菌體產(chǎn)生耐酸應(yīng)答效應(yīng)，該效應(yīng)使雙歧桿菌在致死的pH值環(huán)境下的脅迫耐受能力增強(qiáng)[35]。

目前已有研究表明F0F1-ATPase與雙歧桿菌的耐酸性有關(guān)，該酶活性越高，雙歧桿菌耐酸性越強(qiáng)，推測(cè)雙歧桿菌可能利用該酶的質(zhì)子泵功能將H+排出胞外[13，36～38]；另有研究表明，在酸脅迫狀態(tài)下，雙歧桿菌的氨基酸代謝相關(guān)酶表達(dá)量升高，胞內(nèi)NH4+累積量增多，說(shuō)明雙歧桿菌可能利用氨基酸答謝產(chǎn)生NH3，中和胞內(nèi)多余H+[39]。為進(jìn)一步探討雙歧桿菌的耐酸應(yīng)答機(jī)制，還有學(xué)者利用RNA-seq技術(shù)研究了雙歧桿菌在耐酸應(yīng)答中全基因組轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果表明，有500 余個(gè)基因表達(dá)水平在耐酸應(yīng)答中發(fā)生改變，對(duì)這些基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除利用上述兩種酸脅迫應(yīng)答機(jī)制外，雙歧桿菌可能通過(guò)活躍半胱氨酸-硫胱醚代謝循環(huán)來(lái)產(chǎn)生NH3，中和胞內(nèi)多余H+；另外，與DNA和蛋白質(zhì)保護(hù)及修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)量升高，來(lái)避免H+對(duì)胞內(nèi)大分子的損傷。除150 個(gè)基因與直接抵御H+脅迫有關(guān)，其余近400個(gè)基因的表達(dá)變化原因無(wú)法被明確解釋?zhuān)渲邪ㄈ后w感應(yīng)系統(tǒng)LuxS/AI-2中的luxs基因，部分蛋白激酶編碼基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白編碼基因。

2.2 膽鹽脅迫

膽鹽脅迫是雙歧桿菌在胃腸道中必須克服的第二道生理屏障。雙歧桿菌通過(guò)膽鹽脅迫應(yīng)答能夠形成具有穩(wěn)定表型的耐膽鹽菌株[40]，同時(shí)對(duì)其它脅迫的耐酸能力增強(qiáng)[8，9，36，41]。另外，雙歧桿菌膽鹽脅迫耐受性與其碳水化合物代謝特征[8，9，41，42]，壁膜膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成[8，42]，以及與腸道病原菌競(jìng)爭(zhēng)能力有關(guān)[43，44]。

脂質(zhì)組成、膜蛋白特征和細(xì)胞壁功能在雙歧桿菌耐膽鹽脅迫中發(fā)揮著重要的作用[8，42，45]。產(chǎn)生胞外多糖是雙歧桿菌抵御膽鹽脅迫的一種機(jī)制[46，47]，最近的研究表明，胞外多糖的產(chǎn)量和膽鹽脅迫耐受力之間有直接關(guān)系[46]。此外，膽鹽脅迫抑制了動(dòng)物雙歧桿菌（B.animalis subsp.lactis）中與脂肪酸和磷脂合成有關(guān)酶的表達(dá)[14]。細(xì)胞膜脂質(zhì)組成的改變降低了膽鹽向細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散的速率，提高了菌體膽鹽耐受力。根據(jù)已有研究結(jié)果，有如下推測(cè)：雙歧桿菌的表面相關(guān)蛋白，如一些粘附素，在受膽鹽脅迫時(shí)表達(dá)量會(huì)增加。這些蛋白質(zhì)能增強(qiáng)雙歧桿菌在人類(lèi)腸道中的定殖[48]。

細(xì)胞膜是膽鹽的主要靶位點(diǎn)之一，細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞膜上外排泵解除膽鹽的毒性。雙歧桿菌中已報(bào)道了兩個(gè)膽鹽外排泵——Ctr和BetA，它們與膽鹽的耐受性有直接聯(lián)系[49]。不同的雙歧桿菌對(duì)膽鹽脅迫應(yīng)答的機(jī)制不同[14]。長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum）中大多數(shù)與糖酵解途徑相關(guān)的酶在膽鹽脅迫時(shí)會(huì)過(guò)量表達(dá)，而動(dòng)物雙歧桿菌（B.animalis）中僅有幾種酶表達(dá)量會(huì)上調(diào)，如木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)酮酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶。這一研究結(jié)果說(shuō)明，在應(yīng)對(duì)膽鹽脅迫時(shí)，長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum）消耗葡萄糖的能力增強(qiáng)，而動(dòng)物雙歧桿菌（B.animalis）的葡萄糖消耗能力減弱。

動(dòng)物雙歧桿菌（B.animalis）膽鹽耐受力還與膽鹽水解酶產(chǎn)量和活性有關(guān)[50]。膽鹽水解酶負(fù)責(zé)膽鹽的早期解離，但目前為止，它在膽鹽脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)制還不清楚[51]。有研究表明，雖然膽鹽水解酶的表達(dá)量并不受膽鹽的調(diào)節(jié)，但是其在耐膽鹽中也發(fā)揮了一些作用。相反，在體內(nèi)試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，在長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum）的細(xì)胞內(nèi)積累的膽鹽水解酶在兔子的胃腸道中存在，說(shuō)明除膽鹽外其它因子可能誘導(dǎo)了膽鹽水解酶的表達(dá)[52]。

3 小結(jié)與展望

雙歧桿菌的脅迫應(yīng)答很復(fù)雜，包含一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。雙歧桿菌在食品中的應(yīng)用很廣泛，但是有關(guān)脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制研究卻很少。近十年來(lái)，由功能基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)支持的生理學(xué)分析，為我們提供了一些雙歧桿菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的分子信息。這一領(lǐng)域在未來(lái)的研究中，必須充分利用細(xì)菌基因組項(xiàng)目和人類(lèi)微生物組計(jì)劃的大量數(shù)據(jù)，這將有利于理解雙歧桿菌在人類(lèi)宿主中的生存。另外，脅迫應(yīng)答的研究中，通過(guò)建立應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的耐脅迫表型，產(chǎn)生良好的菌株性能，將使我們了解影響雙歧桿菌性能的因素及如何合理的提高，同時(shí)也為益生菌的功能性研究提供了信息。

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