重組溶葡萄球菌酶粉的抑殺菌效果試驗(yàn)

文 / 陸 珉 錢春妹 張魯敬 解 虹 黃青山，2

（1 江蘇昆山博青生物科技有限公司 2上海復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

重組溶葡萄球菌酶粉是以重組溶葡萄球菌酶為原料，經(jīng)低溫冷凍干燥而制成的單方制劑。本制劑作為抗菌藥，是通過裂解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽鍵橋進(jìn)而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，使其死亡，進(jìn)而達(dá)到殺滅病原菌的目的。重組溶葡萄球菌酶粉一類新獸藥已經(jīng)于2009年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)上市，目前已經(jīng)在奶牛子宮內(nèi)膜炎與乳房炎的預(yù)防和治療中得到廣泛應(yīng)用，主要用于治療革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌或化膿隱秘桿菌等引起的牛急性和慢性子宮內(nèi)膜炎，隱性乳房炎和臨床型乳房炎，并產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。但在成品檢測項(xiàng)目中，重組溶葡萄球菌酶粉并沒有體現(xiàn)其抑菌效果，為了能夠更清晰地表明重組溶葡萄球菌酶粉在奶牛體內(nèi)的抑菌效果，本文在實(shí)驗(yàn)室條件下，對其進(jìn)行了藥物常規(guī)使用劑量稀釋后的抑菌率檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003）]、停乳鏈球菌（ATCC 35666）、無乳鏈球菌（ATCC 624）、化膿隱秘桿菌（ATCC 19411），以上菌種均來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 藥物

重組溶葡萄球菌酶粉400 單位/瓶（批號：20120301）；重組溶葡萄球菌酶粉800 單位/瓶（批號：20120203），購于昆山博青生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

細(xì)菌培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基，購自上海研生生化試劑有限公司；血瓊脂培養(yǎng)基，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；中和劑，自行配制，并鑒定合格，原料購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

雙人超凈臺（SW-CJ-2D），蘇州凈化設(shè)備有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9080MBE）和霉菌培養(yǎng)箱（MJX-160B-Z），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；移液器（200 μL、1 mL、5 mL）及配套的塑料吸頭，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電動(dòng)混勻器。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 細(xì)菌懸液制備程序[1]

2.1.1 培養(yǎng)基選擇。金黃色葡萄球菌選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌）選用KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基，化膿隱秘桿菌選用血瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.2 金黃色葡萄球菌、鏈球菌（無乳鏈球菌和停乳鏈球菌）、化膿隱秘桿菌菌懸液制備。取第 3～6 代的培養(yǎng)了18～20 h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用吸管吸取5.0 mL稀釋液（稀釋用TPS，即酸化水用生理鹽水）加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用吸管將洗液移至另一無菌試管中，用電動(dòng)混勻器混合20 s，或在手掌上振打80 次，以使細(xì)菌懸浮均勻。

2.1.3 初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度，然后用稀釋液稀釋至所需濃度。

2.1.4 細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4 ℃冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當(dāng)天使用不得過夜。

2.1.5 懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭氏染色與生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。

2.2 抑殺菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 按照2.1配制實(shí)驗(yàn)用菌懸液，使其濃度為 1×108～5×108CFU/mL。

2.2.2 藥物使用劑量

（1）重組溶葡萄球菌酶粉，每瓶為400 單位，分別取2 瓶，用無菌水稀釋至200 mL、500 mL及800 mL。

（2）重組溶葡萄球菌酶粉，每瓶為800 單位，分別取2 瓶，用無菌水稀釋至200 mL、500 mL及800 mL。

2.2.3 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)

取4 mL重組溶葡萄球菌酶凍干粉稀釋液加入1 mL實(shí)驗(yàn)用菌懸液，混勻，反應(yīng)10 min后，取0.5 mL加入4.5 mL中和劑中，混勻，中和反應(yīng)10 min。吸取 1.0 mL 樣液，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測定存活菌數(shù)，每管樣液接種 2 個(gè)平皿。如平板上生長的菌落數(shù)較多時(shí)，可進(jìn)行10 倍系列稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

2.2.4 平行實(shí)驗(yàn)

同時(shí)用無菌水代替凍干粉稀釋液，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，作為陽性對照。

2.3 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

重復(fù)抑殺菌實(shí)驗(yàn)3 次，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 重組溶葡萄球菌酶粉對金黃色葡萄球菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，不同規(guī)格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對金黃色葡萄球菌的抑殺菌能力都在88%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。

3.2 重組溶葡萄球菌酶粉對鏈球菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，不同規(guī)格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對鏈球菌的抑殺菌能力都在80%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。重組溶葡萄球菌酶粉對無乳鏈球菌和停乳鏈球菌的抑殺菌效果無明顯差異。

3.3 重組溶葡萄球菌酶粉對化膿隱秘桿菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同規(guī)格的重組溶葡萄球菌酶粉在常用3 種稀釋濃度下，對化膿隱秘桿菌的抑殺菌能力都在80%以上，隨著稀釋濃度的降低，殺菌效果逐步減弱。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組溶葡萄球菌酶粉在常規(guī)的藥物劑量下，對金黃色葡萄球菌具有良好的抑殺菌效果，對無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、化膿隱秘桿菌有一定的抑殺菌效果。

5 討論

重組溶葡萄球菌酶作為基因重組大腸桿菌表達(dá)的酶類生物制劑，主要通過溶解細(xì)菌細(xì)胞壁而殺死細(xì)菌，而非抑制細(xì)菌生長繁殖達(dá)到殺菌效力，是一種高效的生物殺菌劑[2]，特別是對有抗生素耐藥性的細(xì)菌有非常好的殺菌效果，且不會在動(dòng)物體內(nèi)殘留。以上這些優(yōu)點(diǎn)使重組溶葡萄球菌酶成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

金黃色葡萄球菌、鏈球菌、化膿隱秘桿菌都是導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎的主要致病菌[3，6]，并且混合感染和單一感染同時(shí)存在，且混合感染率明顯高于單一感染率。在臨床上，重組溶葡萄球菌酶對革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌、鏈球菌、化膿棒狀桿菌或化膿隱秘桿菌等引起的牛急性、慢性子宮內(nèi)膜炎，隱性乳房炎和臨床型乳房炎有良好的療效。

表1 重組溶葡萄球菌酶粉對金黃色葡萄球菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 重組溶葡萄球菌酶粉對鏈球菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 重組溶葡萄球菌酶粉對化膿隱秘桿菌的抑殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重組溶葡萄球菌酶是通過生物發(fā)酵生產(chǎn)得到的，其生產(chǎn)過程具有安全、無污染、環(huán)保、無廢棄物、無輻射等優(yōu)點(diǎn)。Robert J W的農(nóng)業(yè)食品安全調(diào)查小組調(diào)查報(bào)告顯示[7]：現(xiàn)在仍沒有很有效的方法預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎。溶葡萄球菌酶是目前最有效的殺滅金黃色葡萄球菌的生物制劑。溶葡萄球菌酶在治療奶牛乳腺炎時(shí)的藥物殘留對動(dòng)物和飲用牛奶的消費(fèi)者無害；其在牛奶中有殺菌活性，并且不改變牛奶的物理、化學(xué)或營養(yǎng)成分；同時(shí)，由于乳酪和酸奶制品涉及到有益菌的培養(yǎng)，溶葡萄球菌酶在巴氏殺菌時(shí)可被滅活并且不影響正常的有益菌的培養(yǎng)過程。因此，用溶葡萄球菌酶治療哺乳期奶牛金黃色葡萄球菌菌感染是目前為止最有效、最安全的方法，而且對保護(hù)生態(tài)環(huán)境和生產(chǎn)綠色食品具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

[1]衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范.北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2002：15124

[2]Bastos， M.d.C.d.F.， B.G.Coutinho，M.L.V.Coelho.Lysostaphin： a staphylococcal bacteriolysin with potential clinical applications.Pharmaceuticals， 2010（3）：1139-1161.

[3]王國卿，王洪海，郭夢堯，等.奶牛產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎病原的分離與鑒定.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（10）：10-12.

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[7]Robert J.Wall.By way of example.Biotechnological defence against mastitis diense.Agricultural outlook forum presentel.2006（2）：17.