肝素和硫酸乙酰肝素前體Heparosan的合成研究進展

夏亞穆，戴曉麗

（青島科技大學化工學院，山東 青島266042）

糖胺聚糖（GAGs）是一類由重復的二糖單元組成的不分支的帶負電荷的多糖，通過參與細胞粘附、趨化因子信號傳導、生化級聯(lián)、信號轉(zhuǎn)導以及病原體識別等在細胞中起到關(guān)鍵作用。鑒于其生理功能，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應用潛力的化合物［1，2］。其中，肝素（Hep）和硫酸乙酰肝素（HS）是糖胺聚糖家族的重要成員，是一類由糖醛酸和D－葡糖胺二糖重復單元以1，4－位鍵連接形成的線性多糖，其結(jié)構(gòu)復雜、生物活性多樣［3－6］，研發(fā)肝素和硫酸乙酰肝素新藥已成為近年來多糖藥物研究的熱點。

Heparosan，又稱 N－Acetylheparosan，［β－D－1，4－GlcA－α－D－GlcNAc］n（其中：GlcA 代表葡糖醛酸、Glc－NAc代表N－乙酰氨基葡糖），是肝素和硫酸乙酰肝素共同的前體，也是它們合成過程中最重要的模板［7］。作者在此介紹了肝素／硫酸乙酰肝素的合成方法，綜述了Heparosan的合成研究進展，并對生物工程領(lǐng)域合成Heparosan的前景進行了展望。

1 肝素／硫酸乙酰肝素的合成方法

1．1 肝素／硫酸乙酰肝素的傳統(tǒng)合成

傳統(tǒng)的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法有：動物衍生品的活性物質(zhì)的復原、化學合成法和酶合成法。大多數(shù)商業(yè)化抗凝血劑肝素產(chǎn)品都是從豬腸粘膜中提取得到的［8］，而酶合成法和化學合成法結(jié)合的化學酶法可用于生產(chǎn)特定的肝素／硫酸乙酰肝素。

傳統(tǒng)的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法都有一定的缺點。使用動物衍生品的生產(chǎn)方式并不能得到同質(zhì)和明確的產(chǎn)品，并且有潛在的安全風險［9］。肝素低聚物的化學合成很困難，在經(jīng)濟上不可行。近年來發(fā)展的模塊式合成和“一鍋法”反應使得肝素類寡糖的化學合成取得了長足進展，但目前的策略仍然是特定序列導向的定向合成?；瘜W酶法為肝素／硫酸乙酰肝素的合成提供了一條新的途徑，使得深入的構(gòu)效關(guān)系（SAR）研究成為可能。然而，化學酶法要用于肝素／硫酸乙酰肝素的大量合成還需要解決酶的來源以及糖基給體的大量合成［3］。因此，為了確保肝素／硫酸乙酰肝素的生產(chǎn)符合成本效益并保證安全，以及合成明確的基于肝素／硫酸乙酰肝素的藥物，需要開發(fā)能精密控制合成步驟的新的肝素／硫酸乙酰肝素合成方法，如生物合成法等。

1．2 肝素／硫酸乙酰肝素的生物合成

肝素／硫酸乙酰肝素的生物合成是在高爾基體內(nèi)通過復雜的多酶體系實現(xiàn)的。首先，一個木糖（Xyl）殘基、兩個半乳糖（Gal）殘基和一個葡糖醛酸（GlcA）殘基逐步連接到核心蛋白的特殊絲氨酸殘基上［10］，從而形成連接子四糖β－GlcA－（1，3）－β－Gal－（1，3）－β－Gal－（1，4）－β－Xyl，它是合成 Heparosan的模板［11］。1，4－位鍵連接的GlcNAc和GlcA單糖單元交替連接到連接子四糖上構(gòu)成肝素多糖鏈，從而形成Heparosan，然后在一系列酶的加工下將其轉(zhuǎn)化為肝素／硫酸乙酰肝素：N－去乙?；福疦－磺酸基轉(zhuǎn)移酶（NDST），可以將GlcNAc單元上的N－乙?；摮β懵冻鰜淼陌被M行硫酸化修飾；C－5－位差向異構(gòu)酶（C－5－Epi）通過對GlcUA的C－5－位構(gòu)型翻轉(zhuǎn)將其轉(zhuǎn)化為L－艾杜糖醛酸（L－IdoA）；2－位O－磺酸基轉(zhuǎn)移酶（2－OST）對IdoA 的C－2－位羥基進行硫酸化；3－位和6－位O－磺酸基轉(zhuǎn)移酶（3－OST和6－OST）催化葡萄糖胺單元的 C－3－位和 C－6－位羥基引入磺酸基［3］。肝素和硫酸乙酰肝素的合成的差異發(fā)生在最后一步：已修飾的肝素蛋白聚糖的多糖鏈經(jīng)內(nèi)切β－D－葡糖醛酸糖苷酶在一些GlcA殘基處裂解以得到更短的游離肝素鏈；內(nèi)切硫酸酯酶通過減少O－硫酸化基團的數(shù)目，參與硫酸乙酰肝素的硫酸化模式［12，13］。

2 Heparosan的合成研究進展

2．1 從微生物中提取Heparosan

迄今為止，Heparosan聚合物被發(fā)現(xiàn)存在于致病菌大腸桿菌 K5（E．coli K5）、D型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida Type D）和副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）的莢膜中。但是只有大腸桿菌K5被報道已用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)Heparosan。研究顯示，發(fā)酵產(chǎn)物Heparosan的分子量受到培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件的影響，大規(guī)模發(fā)酵能夠得到15g·L－1的發(fā)酵得率。Manzoni等［14，15］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 K5發(fā)酵后，由于培養(yǎng)基中出現(xiàn)裂解酶，Heparosan分子量分別為16kDa和1．5kDa。Wang等［16］報道了較高分子量的 Heparosan（50～80kDa）。

現(xiàn)階段用于化學酶法合成肝素／硫酸乙酰肝素的Heparosan模板都是從大腸桿菌K5莢膜中得到后被降解到目標長度。Heparosan的降解分離是通過從肝素黃桿菌中得到的肝素酶來完成，這種方法會產(chǎn)生不飽和寡糖，這些不飽和糖醛酸殘基的雙鍵可利用汞鹽或臭氧分解除去。據(jù)報道，一種二氧化鈦催化光化學反應被用于控制Heparosan的解聚反應，不會產(chǎn)生不飽和寡糖。這種方法雖有一定的應用前景，但仍需進一步研究才能用于藥用肝素／硫酸乙酰肝素的生產(chǎn)。盡管利用微生物生產(chǎn)Heparosan符合成本效益，對發(fā)酵產(chǎn)物Heparosan的解聚反應也已有研究，但仍不能嚴格控制和調(diào)節(jié)Heparosan的鏈長度和糖殘基組成。由于Heparosan鏈上的GlcA和GlcNAc只有在聚合鏈合成之后才能被修飾，而控制聚合后修飾比較困難，通過在Heparosan鏈延伸過程中添加類似的糖來更精確地控制鏈結(jié)構(gòu)成為研究的重點，比如以IdoA代替GlcA。

2．2 利用重組酶合成Heparosan

在哺乳動物細胞和微生物中，Heparosan通過糖基轉(zhuǎn)移酶來合成，這種酶以尿苷二磷酸－糖（UDP－糖）為供體，交替地催化GlcNAc和GlcA殘基轉(zhuǎn)移到不斷延伸的聚合物鏈上。

2．2．1 來自哺乳動物和果蠅的重組Heparosan合酶

哺乳動物的糖基轉(zhuǎn)移酶EXT1和EXT2能夠催化Heparosan鏈的延伸，EXT1和EXT2共同形成一個活潑雜絡物，它們在重組細胞中的同時表達可以達到最強的催化活性。EXT1／2絡合體與單獨的EXT1一樣通過添加一些額外的糖單元（10～20個糖單元），使大腸桿菌K5的Heparosan受體延伸。與EXT1不同的是，在沒有EXT1、單獨培養(yǎng)EXT2時并不能觀察到顯著的轉(zhuǎn)移酶活性。Kim等［17］研究發(fā)現(xiàn)，以GlcAGal－O－C2H4NH－芐氧羰基作為模板時，純化的EXT1／2絡合體能合成約170kDa的Heparosan聚合體。如果以磷脂酰肌醇蛋白聚糖－I核心蛋白或α－血栓調(diào)節(jié)蛋白聚糖作為模板則能合成約200kDa的Heparosan聚合體。目前未見關(guān)于哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和聚合物鏈長度延伸調(diào)節(jié)的詳細分析。在果蠅中，一類與哺乳動物EXT同源的蛋白TTV、SOTV和BOTV參與合成Heparosan。

2．2．2 來自大腸桿菌K5的重組Heparosan合酶

在大腸桿菌K5中，Heparosan的合成主要受葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶（KfiA）和葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（KfiC）的調(diào)節(jié)，它們在Heparosan的非還原末端進行活化的單糖單元的轉(zhuǎn)移和鏈的延伸。Sugiura等［18］在大腸桿菌BL21（DE3）中表達出KfiC和KfiA，并發(fā)現(xiàn)在酶作用底物和模板分子的存在下，當只有KfiC時并未表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移酶活性，而只有KfiA時表現(xiàn)出了GlcNAc轉(zhuǎn)移酶活性；此外，過量KfiA的存在能提高聚合活性，而過量KfiC的存在對聚合活性沒有影響；在Heparosan寡糖模板（七聚體）存在下，分別培養(yǎng)KfiA／KfiC絡合體8h或18h能合成約10kDa和20kDa的Heparosan鏈。Liu等［19］發(fā)現(xiàn)KfiA和PmHS2的結(jié)合可用于控制Heparosan低聚糖的延伸。

2．2．3 來自D型多殺性巴氏桿菌的重組Heparosan合酶

Heparosan在D型多殺性巴氏桿菌中的合成有別于大腸桿菌K5，它受到一個雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶Pm－HS1的控制。之后PmHS1同源物PmHS2也被鑒定出來。它們雖然有很高的氨基酸水平的同源性（73%），但重組PmHS1和PmHS2表現(xiàn)出不同的聚合特性。Sismey－Ragatz等［20］研究在模板缺少或存在條件下多殺性巴氏桿菌GAG合酶的聚合作用時發(fā)現(xiàn)了GAG合酶PmHS1（Heparosan合酶）和PmHAS（透明質(zhì)酸合酶）之間的相似性：它們都表現(xiàn)出對短的低聚糖受體位點比對UDP－糖更高的親和性。在反應混合物中加入低聚糖模板能避免聚合物鏈的引發(fā)，有利于合成更窄的長度分布的鏈。通過控制PmHAS和UDP－糖／透明質(zhì)酸模板的量，可以得到分子量明確（16～2000kDa）、分布較窄的多分散性聚合物。因此，在與PmHAS相似的條件下，PmHS1也可能控制Heparosan的延伸。然而，Chavaroche等［21］發(fā)現(xiàn)與PmHS1和PmHAS相比，PmHS2并未表現(xiàn)出同樣的親和性。聚合物鏈的引發(fā)受控于聚合反應中的UDPGlcNAc親和性，當Heparosan模板在過量的UDPGlcA存在下培養(yǎng)時能得到更窄的長度分布。

除了利用PmHS，通過多殺性巴氏桿菌糖基轉(zhuǎn)移酶控制Heparosan延伸的方法也可由另一途徑實現(xiàn)。Coutinho等［22］發(fā)現(xiàn)以天冬酰胺（N）替代位于催化中心的DXD氨基酸基序中的2個天冬氨酸（D）會導致催化結(jié)構(gòu)域的失活。PmHS1和PmHS2單動轉(zhuǎn)移酶突變體已在DXD序列上通過相應的定向誘變得到［21，23］。當PmHS1和PmHS2的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（PmHS－GlcA＋）和乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶（PmHS－Glc－NAc＋）一起培養(yǎng)時，能夠通過轉(zhuǎn)移一個GlcA和一個GlcNAc殘基來延伸Heparosan。在沒有低聚糖模板時，PmHS2能引發(fā)和延伸 Heparosan鏈，并且只有PmHS2－GlcA＋能夠引發(fā) Heparosan合成［21］。此外，PmHS2通過轉(zhuǎn)移修飾后的糖表現(xiàn)出聚合特性。Pm－HS2單動轉(zhuǎn)移酶已被逐步用于Heparosan低聚糖的合成，值得注意的是 PmHS2－GlcA＋和 PmHS2－Glc－NAc＋并不需要形成絡合體來表現(xiàn)催化活性［24］。Sismey－Ragatz等［20］報 道 在 二 糖 受 體 （GlcA－AnMannose）存在下，KfiA和PmHS2實現(xiàn)了Heparosan的逐步延伸。但是由于PmHS2的雙重作用，須謹慎控制合成過程?？傊?，多殺性巴氏桿菌Heparosan合酶在已知的Heparosan合酶中是個特例。由雙功能單動轉(zhuǎn)移酶組成的PmHS2能從UDP－糖類似物延伸，有利于控制Heparosan的合成，從而產(chǎn)生有新的生物特性的肝素／硫酸乙酰肝素。

2．3 利用轉(zhuǎn)基因細菌合成Heparosan

目前還沒有利用轉(zhuǎn)基因細菌合成Heparosan的報道，但轉(zhuǎn)基因細菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸已經(jīng)成功實現(xiàn)。透明質(zhì)酸由和Heparosan一樣的糖單元、不同的糖苷連接（β－D－1，3－GlcNAc－β－D－1，4－GlcA）n組成。類馬鏈球菌透明質(zhì)酸合酶hasA基因和UDP－葡萄糖脫氫酶基因在枯草桿菌中的表達能夠得到g·L－1級別的透明質(zhì)酸（1．1～1．2MDa）［25］，產(chǎn)率與透明質(zhì)酸的天然生產(chǎn)菌類馬鏈球菌菌株（7g·L－1）相近［26］。此外，源自多殺性巴氏桿菌的透明質(zhì)酸合酶也在大腸桿菌中被表達出來，并成功生產(chǎn)透明質(zhì)酸。這一發(fā)現(xiàn)有望應用于重組大腸桿菌產(chǎn) Heparosan［27］。

3 結(jié)語

控制Heparosan的合成是生產(chǎn)肝素／硫酸乙酰肝素的關(guān)鍵步驟。Heparosan合成方法各有利弊。盡管從細菌莢膜中分離Heparosan具有一定的經(jīng)濟效益，但大腸桿菌K5是一個人類病原菌，當其用于藥用化合物的生產(chǎn)時，需經(jīng)過多輪隨機突變以減少毒性［26］。此外，細菌莢膜生產(chǎn)Heparosan并不能控制鏈的延伸和二糖單元組成［28］。由于非致病性微生物的可用性，調(diào)節(jié)Heparosan合酶的表達能夠部分控制聚合物的合成，然而，現(xiàn)有的技術(shù)水平還不能控制聚合物鏈的長度。由于多殺性巴氏桿菌Heparosan合酶PmHS2的雙功能單動轉(zhuǎn)移酶活性，其在沒有模板存在下引發(fā)Heparosan鏈的能力以及可從UDP－糖延伸的特點，PmHS2被看作是剪裁肝素／硫酸乙酰肝素鏈最適合的生物催化劑?？梢哉J為，盡管需要UDP－糖再生方法，相對于控制聚合物分子量［21］和改性UDP－糖的整合［20］來合成特定的Heparosan聚合體，使用體外生物催化劑的合成方法是最有前途的。此外，利用轉(zhuǎn)基因細菌合成Heparosen的應用潛力較大。

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