豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸的提取純化工藝

張 飛，趙靜國，趙蒙浩

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023）

豬膽汁酸是豬膽汁的主要成分，約占豬膽汁總量的50%～70%，主要有豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬膽酸等，其中豬去氧膽酸約占40%、鵝去氧膽酸約占25%。豬去氧膽酸具有降血脂、鎮(zhèn)痙、祛痰等作用，為人工牛磺的重要成分，臨床上可用于治療高血脂癥、氣管炎以及由肝膽疾病引起的消化不良，對百日咳菌、白喉桿菌、金黃色葡萄球菌亦有抑制作用[1］。周維善等[2］還以豬去氧膽酸為原料，合成了具有生理活性的甾體物質(zhì)。鵝去氧膽酸在臨床上不僅用作溶解膽固醇類結(jié)石和糾正飽和膽汁的藥物，還具有顯著的平喘、抗炎、鎮(zhèn)咳和祛痰等作用。鵝去氧膽酸也是昂貴的熊去氧膽酸的合成原料，它們都是治療膽道疾病的有效藥物[3］。目前人們主要利用豬膽汁提取豬去氧膽酸或鵝去氧膽酸，豬去氧膽酸主要用大量乙酸乙酯進(jìn)行提取[4］，乙酸乙酯提取物經(jīng)丙酮重結(jié)晶、甲醇（乙醇）－水重結(jié)晶或直接用柱層析[1］進(jìn)行純化，這幾種方法不僅溶劑消耗量大，產(chǎn)品純度也低。鵝去氧膽酸的提取方法主要有鋇鹽沉淀法[5］、鈣鹽沉淀法[6］、離子交換樹脂法[7］，這些提取方法產(chǎn)品收率低，純度也僅90%左右。很少有工藝能同時將豬膽汁中的豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸提取出來。

作者根據(jù)Zlegler等[8］報道，從提取膽紅素后的豬膽粉中同時提取豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸，效果較好。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

豬膽粉，上海長城藥業(yè)有限公司。

柱層析硅膠、薄層硅膠板，青島海浪硅膠干燥劑廠。

除HPLC所用試劑為色譜純外，其余試劑均為分析純。

YRT－3型熔點儀，天津大學(xué)精密儀器廠；Mercury Plus－400型核磁共振氫譜儀，美國Varian公司；戴安P680型高效液相色譜儀[Grace Davison Discovery Sciences C18色譜柱（4.6mm×250mm），以乙腈－磷酸鹽（50∶50）緩沖溶液為流動相，檢測波長為210 nm］；戴安UVD170U型檢測器。

1.2 方法

1.2.1 混合豬膽汁酸粗品制備

在2L圓底燒瓶中加入豬膽粉100g、10%氫氧化鈉溶液1000mL，加熱回流20h，皂化完全后，靜置冷卻至室溫，出現(xiàn)分層，底部有膠狀沉淀，虹吸抽去上層黃色液體，沉淀加少量水溶解，抽濾，濾液加入少量活性炭脫色，再次抽濾，收集濾液，加入10%稀鹽酸酸化至pH值1～2，靜置過濾，沉淀水洗至中性，于50℃真空干燥，得混合豬膽汁酸粗品65g，收率（以豬膽粉計）65%。

1.2.2 混合豬膽汁酸的甲酯化

在500mL圓底燒瓶中加入混合豬膽汁酸粗品50g、甲醇300mL，攪拌溶解后，加入30mL濃鹽酸，回流攪拌3h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后，以無水NaHCO3固體調(diào)pH值至中性，過濾去除無機鹽，濾餅用甲醇洗滌，合并濾液及洗液，減壓回收甲醇，得棕褐色粘稠狀物和白色無機鹽。用乙酸乙酯提取，濾除無機鹽，分別以飽和NaHCO3溶液和水洗滌，無水MgSO4干燥4h，抽濾，減壓去除乙酸乙酯，得棕褐色粘稠狀混合豬膽汁酸甲酯51g。

1.2.3 豬去氧膽酸的提取與純化

向裝有混合豬膽汁酸甲酯的燒瓶中加入甲苯60mL，于70℃油浴下溶解完全后停止加熱，趁熱倒入結(jié)晶皿中，自然冷卻至室溫后放入冰箱約4h，析出白色凍狀物，抽濾，濾餅以少量甲苯洗滌2～3次，得到白色固體，固體再用甲苯重結(jié)晶，于50℃真空干燥，得白色固體20.1g，經(jīng)薄層色譜檢測為單一斑點（V乙酸乙酯∶V石油醚＝2∶1，5%磷鉬酸乙醇溶液顯色，Rf值為0.35），即豬去氧膽酸甲酯。

在250mL燒瓶中加入豬去氧膽酸甲酯20.1g、氫氧化鈉4g、乙醇50mL和水20mL，攪拌回流反應(yīng)6h，TLC（展開劑：V乙酸乙酯∶V石油醚∶V甲酸＝5∶5∶0.6，5%磷鉬酸乙醇溶液顯色，Rf值為0.42）監(jiān)測反應(yīng)完畢后，減壓回收溶劑至干，得淡黃色固體，加水50mL溶解，攪拌下用10%鹽酸溶液調(diào)pH值1～2，析出固體，抽濾，濾餅用水洗滌至中性，于50℃真空干燥得到白色固體粉末19.0g，純度經(jīng)HPLC檢測為98.6%。收率38%。

1.2.4 鵝去氧膽酸的提取與純化

將1.2.3項下的濾液、洗液以及重結(jié)晶母液合并，減壓回收甲苯至干，得到棕色粘稠狀物25g。取硅膠約300g以干法裝柱，取混合豬膽汁酸甲酯10g上樣，以乙酸乙酯－石油醚（體積比1∶1）洗脫，TLC（展開劑：V乙酸乙酯∶V石油醚＝2∶1，5%磷鉬酸乙醇溶液顯色，Rf值為0.58）監(jiān)測分離進(jìn)程，收集含鵝去氧膽酸甲酯的洗脫液，直至第二個點出現(xiàn)時停止。

將所得洗脫液減壓濃縮，得到淡黃色粉末狀固體4g，分別加入乙醇20mL、氫氧化鈉1g和水5mL，攪拌回流反應(yīng)6h，TLC（展開劑：V乙酸乙酯∶V石油醚∶V甲酸＝5∶5∶0.6，5%磷鉬酸乙醇溶液顯色，Rf值為0.55）監(jiān)測反應(yīng)完畢后，減壓回收溶劑至干，得淡黃色固體，加水10mL溶解，攪拌下用10%鹽酸溶液調(diào)pH值1～2，析出固體，抽濾，濾餅用水洗滌至中性，于50℃真空干燥得到淡黃色固體3.7g，純度經(jīng)HPLC檢測為99.0%。收率18.5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

（1）豬去氧膽酸：m.p.201～202℃；1HNMR（400 MHz，DMSO－d6），δ：11.95（s，1H，24－COOH），4.42（d，1H，3－OH），4.24（d，1H，6－OH），3.83（m，1H，6－CH），3.57（m，1H，3－CH），0.91（d，3H，21－CH3），0.84（s，3H，19－CH3），0.60（s，3H，18－CH3）。與文獻(xiàn)值[1］基本一致。

（2）鵝去氧膽酸：m.p.142～143℃。1HNMR（400 MHz，CDCl3），δ：0.66（3H，s，13－CH3），0.90（3H，s，10－CH3），0.92（3H，d，20－CH3），3.48（1H，br，3－H），3.85（H，br，7－H）），與文獻(xiàn)值[9］基本一致。

2.2 討論

（1）先將豬膽粉皂化處理，混合豬膽汁酸粗品經(jīng)甲酯化，豬去氧膽酸甲酯與甲苯形成復(fù)合物，利用該復(fù)合物不溶于甲苯的特點，即可從甲苯中分離豬去氧膽酸甲酯。雖然用苯也可形成復(fù)合物，但苯的毒性太大，而以毒性較小的甲苯代替苯，提取純度與收率都有所提高，并且操作簡單、節(jié)約溶劑，豬去氧膽酸純度提高到98.6%，收率達(dá)到38%。

（2）利用鵝去氧膽酸甲酯二醋酸酯在有機溶劑中重結(jié)晶的方法提取鵝去氧膽酸，步驟較多，操作繁瑣，產(chǎn)品純度也不高[8］。若直接用層析柱分離豬混合膽汁酸[1］，由于幾種膽汁酸極性偏大，且差異較小，洗脫劑很難將它們分離，而隨意增加洗脫劑極性又易使原料變質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，將原料甲酯化后，分離效率明顯提高。沈季銘等[10］采用石油醚－丙酮體系，丙酮易揮發(fā)、極性易改變。本研究重新探索了洗脫劑的選取，確定為乙酸乙酯－石油醚，在其體積比為1∶1時出現(xiàn)鵝去氧膽酸甲酯單點，分離時間短且分離效果好。

3 結(jié)論

建立了從提取膽紅素后的豬膽粉中同時提取豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸的方法。利用豬去氧膽酸甲酯與甲苯形成的復(fù)合物不溶于甲苯的性質(zhì)將其分離出來，利用柱層析分離得到鵝去氧膽酸甲酯；然后分別經(jīng)堿水解得到高純度的豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸，純度顯著提高。此工藝步驟少、操作簡單、原料利用充分，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]蘇紅，葉利民，楊軼浠，等.豬去氧膽酸的純化工藝[J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21（4）：360－362.

[2]周維善，王鍾麒.從豬去氧膽酸合成具有生物活性的甾體化合物[J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1991，22（1）：30－36.

[3]潘現(xiàn)軍，張曉梅.從豬膽膏中分離純化鵝去氧膽酸的新工藝[J］.河北醫(yī)藥，2006，28（2）：147－148.

[4]陸進(jìn)，杜守穎，趙麗瑞，等.豬去氧膽酸提取工藝研究[J］.中國中藥雜志，2004，29（5）：414－417.

[5]羅小明，吳四維，王星敏.豬膽汁中鵝去氧膽酸的提取[J］.重慶廣播電視大學(xué)學(xué)報，1999，（4）：48.

[6]曹榮安，李良玉，張麗萍.豬膽汁中鵝去氧膽酸提取工藝的研究[J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（4）：12－15.

[7]楊春梅，王洪鐘，胡瑞蘭，等.幾種動物膽汁的組分對比及樹脂法精制CDCA初探[J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，43（6）：467－471.

[8]Zlegler P，Attwell M C，Masslah T F，et al.Chenodeoxycholic acid[P］.CA 1 041 479，1978－10－31.

[9]劉雁紅，胡祥正.鴨膽膏中鵝去氧膽酸的提取工藝[J］.天津科技大學(xué)學(xué)報，2009，24（3）：43－45.

[10]沈季銘，周維善.豬膽汁中膽烷酸的分離和鑒定[J］.醫(yī)藥工業(yè)，1988，（12）：529－531.