L－半胱氨酸與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析

徐大瑋，畢玉琦

（1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南250100；2.山東質(zhì)量認(rèn)證中心，山東 濟(jì)南250014）

L－半胱氨酸（L－Cysteine，L－Cys）是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一，其結(jié)構(gòu)中既有羧基、氨基，又有巰基（－SH），具有重要的生理藥理功能。L－Cys能夠合成谷胱甘肽，還能維持細(xì)胞內(nèi)外的氧化還原狀態(tài)[1］，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[2］、檢測(cè)[3］、食品[4］等領(lǐng)域。在醫(yī)藥行業(yè)，L－Cys的鹽酸鹽具有恢復(fù)肝功能的作用，其衍生物可以作為溶解性祛痰劑[2］；在食品加工行業(yè)，L－Cys具有很好的食品保鮮、抗氧化作用；另外人們還將它應(yīng)用到化妝品行業(yè)中[4］。

血清白蛋白能與進(jìn)入體內(nèi)的許多物質(zhì)進(jìn)行可逆結(jié)合，在體內(nèi)起到貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的作用。因此，研究小分子與血清白蛋白的相互作用對(duì)理解物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)等作用機(jī)制具有重要意義。牛血清白蛋白（BSA）因與人血清白蛋白（HSA）具有相似的結(jié)構(gòu)，常作為體外模型蛋白用于研究。

目前，有關(guān)L－Cys與模型蛋白BSA相互作用的研究還很少見(jiàn)，方盈盈等[5］探討了L－Cys與BSA相互作用的熱轉(zhuǎn)變曲線、變性溫度和變性焓等，但是對(duì)于LCys與BSA的猝滅常數(shù)、結(jié)合作用以及熱力學(xué)參數(shù)的變化至今尚未見(jiàn)報(bào)道。作者在此運(yùn)用熒光光譜法研究了L－Cys與BSA的熒光猝滅機(jī)制，求得了L－Cys與BSA的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)，為全面了解L－Cys在體內(nèi)的貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝作用以及L－Cys的藥理、毒理機(jī)制提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（純度＞98%）、L－半胱氨酸（BR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris試劑、NaCl，分析純；二次去離子水。

LS－55型熒光儀，美國(guó) Perkin Elmer公司；DF－101S型集熱式恒溫槽，鞏義英峪儀器廠；FA2004B型電子天平，上海精密儀器；PH－3C型酸度計(jì)，上海鵬順。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取0.6057g Tris試劑和0.2925g NaCl，溶于50mL 二次去離子水中，并與42mL 0.1mol·L－1的鹽酸均勻混合，用二次去離子水定容至100mL，用酸度計(jì)測(cè)其pH值為7.4，即得到0.05mol·L－1pH＝7.4的 Tris－HCl緩沖溶液，溶液中NaCl的濃度為0.05mol·L－1。

用上述0.05mol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制濃度為1.24×10－6mol·L－1的BSA溶液，低溫保存，備用。

用電子天平準(zhǔn)確稱取 0.6058g L－Cys，溶于50mL二次去離子水中，其濃度為0.1mol·L－1；取10mL上述溶液，稀釋至100mL，即得濃度為1.0×10－2mol·L－1的L－Cys水溶液。

1.2.2 熒光光譜分析

取5mL BSA于比色管中，依次加入不同體積的L－Cys水溶液（加入體積＜100μL，忽略體積對(duì)濃度的干擾），設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為285nm、掃描速率為500nm·min－1、熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫比為8∶8，在溫度為288K、306K時(shí)測(cè)量BSA的熒光光譜，記錄350nm處的熒光強(qiáng)度，并運(yùn)用相關(guān)公式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；在288K時(shí)測(cè)L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜，考察L－Cys對(duì)BSA結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）及苯丙氨酸（Phe）3種生色團(tuán)而產(chǎn)生熒光。三者對(duì)于蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的貢獻(xiàn)差別較大，相對(duì)熒光強(qiáng)度Trp∶Tyr∶Phe為100∶9∶0.5[6］，也就是說(shuō)Trp對(duì)蛋白質(zhì)熒光的貢獻(xiàn)最大，特別是當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為285nm時(shí)，蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的熒光性質(zhì)主要為Trp的熒光性質(zhì)。

不同溫度下，不同濃度L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜見(jiàn)圖1。

圖1 不同溫度下，不同濃度L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA with L－Cys as quencher at different temperatures

由圖1可看出，288K時(shí)，BSA的最大熒光峰位于350nm處；隨著L－Cys濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度不斷降低，發(fā)生了熒光猝滅，且最大發(fā)射峰從350nm藍(lán)移到了347.5nm。表明L－Cys與BSA之間發(fā)生了相互作用，L－Cys使BSA的Trp生色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了改變。

溫度對(duì)溶液的熒光有顯著的影響，溫度升高時(shí)由于分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用會(huì)使溶液的熒光強(qiáng)度下降[7］。由圖1可看出，288K時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度為734，而306K時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度下降至538；當(dāng)LCys的濃度為23.1×10－5mol·L－1時(shí)，288K、306K下的熒光強(qiáng)度分別為472和353，表明溫度對(duì)L－Cys與BSA的相互作用影響顯著。

2.2 L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅機(jī)制

熒光猝滅是熒光物質(zhì)與其它分子之間作用，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的過(guò)程。熒光猝滅的過(guò)程非常復(fù)雜，常見(jiàn)的有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動(dòng)態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子和其它分子之間碰撞造成能量損失而形成的，其能量以無(wú)輻射形式躍遷回基態(tài)，溫度越高猝滅越明顯；而靜態(tài)猝滅是形成基態(tài)復(fù)合物而導(dǎo)致的，受溫度影響較小[7］。猝滅機(jī)制可以通過(guò)Stern－Volmer方程[式（1）］來(lái)研究[8，9］：

式中：F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern－Volmer猝滅常數(shù)；[Q］為猝滅劑的濃度。

繪制不同溫度下的L－Cys對(duì)BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度下，L－Cys與BSA相互作用的Stern－Volmer曲線Fig.2 The Stern－Volmer curves of the interaction between L－Cys and BSA at different temperatures

由圖2可看出，Stern－Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而增大，計(jì)算得到288K、306K時(shí)的Ksv分別為1.69×103L·mol－1、1.89×103L·mol－1。表明，L－Cys與BSA相互作用的猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。

2.3 L－Cys與BSA的結(jié)合作用及熱力學(xué)參數(shù)

L－Cys與BSA 的結(jié)合作用可由式（2）表示[8，9］：

圖3 不同溫度下，L－Cys與BSA相互作用的log[（F0－F）／F］～log[Q］曲線Fig.3 Plots of log[（F0－F）／F］versus log[Q］of the interaction between L－Cys and BSA at different temperatures

由圖3中曲線的斜率和截距求出L－Cys與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，見(jiàn)表1 。

表1 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Binding constants，binding sites，and the thermodynamic parameters at different temperatures

由表1 可看出，隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均相應(yīng)增大。

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變（△H）可以看作常數(shù)，根據(jù)van′t Hoff公式[式（3）］和熱力學(xué)公式[式（4）］求出反應(yīng)的熵變（△S）和吉布斯自由能（△G），結(jié)果見(jiàn)表1 。

蛋白質(zhì)與小分子之間的結(jié)合主要有疏水作用力、范德華力、氫鍵和靜電引力[10］，不同小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的作用力類型不盡相同，當(dāng)△H＞0、△S＞0時(shí)，主要作用力為疏水作用力[11］。

由表1 可看出，△H＞0，說(shuō)明該反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)吸收熱量的過(guò)程，升高溫度有利于反應(yīng)的進(jìn)行，這也與實(shí)際相符；△H＞0、△S＞0，可以判斷L－Cys和BSA之間的作用力主要為疏水作用力；此外，L－Cys的等電點(diǎn)在5.05左右，BSA的等電點(diǎn)在4.6左右，實(shí)驗(yàn)的pH值為7.4，因此L－Cys和BSA都帶負(fù)電，二者之間存在較大的靜電斥力，這也導(dǎo)致二者的結(jié)合作用力較??；考慮到水溶液中水分子和其它共存離子的影響，實(shí)際體系的宏觀表現(xiàn)應(yīng)該是幾種作用力同時(shí)作用的結(jié)果。

2.4 L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜

蛋白質(zhì)中Trp和Tyr殘基的熒光峰位置與蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境密切相關(guān)，因此可以通過(guò)熒光峰位置的改變來(lái)判斷蛋白質(zhì)微環(huán)境的改變。Trp和Tyr的同步熒光光譜見(jiàn)圖4?！鳓耍?0nm時(shí)，主要是Trp的熒光光譜特征；△λ＝15nm時(shí)，主要是Tyr的熒光光譜特征[12］。

圖4 L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA with L－Cys as quencher

由圖4可看出，隨著L－Cys濃度的增大，Trp的最大發(fā)射峰略有藍(lán)移，熒光強(qiáng)度逐漸降低；而Tyr的最大發(fā)射峰位置沒(méi)有大的變化。表明Trp所處的微環(huán)境疏水性增強(qiáng)、極性減弱，這也與L－Cys和BSA之間的作用力主要是疏水作用力相一致。

3 結(jié)論

在模擬動(dòng)物活體生理?xiàng)l件下，運(yùn)用熒光光譜法研究了L－Cys與BSA的相互作用。結(jié)果表明，L－Cys對(duì)BSA的熒光具有猝滅作用，其猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅；L－Cys與BSA之間的作用力主要為疏水作用力；同步熒光光譜顯示，L－Cys使得BSA的Trp微環(huán)境發(fā)生改變，疏水性增強(qiáng)、極性減弱。

[1]陳慧慧，朱瑞旭，郭艷麗，等.L－半胱氨酸修飾的金納米粒子與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究[J］.光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（12）：3276－3280.

[2]賈存江，王英燕，趙麗麗.L－半胱氨酸的生產(chǎn)方法及應(yīng)用進(jìn)展[J］.齊魯藥事，2007，26（9）：553－555.

[3]Ahmadipour M，Taher M A，Beitollahi H，et al.Electrocatalytic determination of L－cysteine using a modified carbon nanotube paste electrode：Application to the analysis of some real samples[J］.Chinese Chemical Letters，2012，23（8）：981－984.

[4]楊美花，李智聰，劉鳳嬌，等.L－半胱氨酸作為化妝品美白添加劑的作用機(jī)理[J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，48（4）：582－584.

[5]方盈盈，張龍，郭愛(ài)娣，等.L－半胱氨酸與牛血清白蛋白的相互作用[J］.廣州化學(xué)，2011，36（2）：12－16.

[6]Ni Y，Liu G，Kokot S.Fluorescence spectrometric study on the interactions of isoprocarb and sodium 2－isopropylphenate with bovine serum albumin[J］.Talanta，2008，76（3）：513－521.

[7]許金鉤，王尊本.熒光分析法[M］.北京：科學(xué)出版社，2006：49－85.

[8]Zhang P J，Lan P，Ma Y N，et al.Spectroscopic investigation on the interaction of Cr（Ⅵ）with bovine serum albumin[J］.J Biochem Mol Toxicol，2012，26（2）：54－59.

[9]徐科，黃亞勵(lì)，劉紅，等.熒光光譜法研究氫化可的松與牛血清白蛋白的結(jié)合作用[J］.化學(xué)與生物工程，2012，29（11）：32－35.

[10]Ross P D，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions：Forces contributing to stability[J］.Biochemistry，1981，20（11）：3096－3102.

[11]Mu Y，Lin J，Liu R.Interaction of sodium benzoate with trypsin by spectroscopic techniques[J］.Spectrochim Acta A：Mol Biomol Spectrosc，2011，83（1）：130－135.

[12]Klajnert B，Bryszewska M.Fluorescence studies on PAMAM dendrimers interactions with bovine serum albumin[J］.Bioelectrochemistry，2002，55（1－2）：33－35.