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    酸奶中桿菌和球菌的快速分離及發(fā)酵劑的制備

    2013-10-15 10:14:42李靖靖
    化學(xué)與生物工程 2013年8期
    關(guān)鍵詞:脫脂乳保加利亞發(fā)酵劑

    付 鴻,李靖靖,岳 春

    (1.中州大學(xué)化工食品學(xué)院,河南 鄭州450044;2.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南 南陽473004)

    近年來,隨著人民生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng),我國發(fā)酵酸乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展[1]。酸奶以其獨(dú)特的風(fēng)味和特有的保健功能越來越受到人們的喜愛,其產(chǎn)量正以每年25%的速度遞增[2],這對(duì)酸奶發(fā)酵劑的品質(zhì)、特性、種類提出了新的要求。目前,我國酸奶發(fā)酵劑的制備大多停留在傳統(tǒng)人工型發(fā)酵劑水平上,一般需要配備專門菌種室、專業(yè)人員、專用設(shè)備,存在工序多、周期長、菌種容易污染和退化等缺點(diǎn),導(dǎo)致酸奶質(zhì)量不穩(wěn)定,影響了企業(yè)的信譽(yù)和酸奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。

    要獲得良好的酸乳制品,其發(fā)酵菌種中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例一般應(yīng)為(1~2)∶1,但由于兩者的生長要求和耐酸能力不同,在繼代培養(yǎng)后兩者的比例會(huì)發(fā)生變化,若干代后的菌種便不能用于生產(chǎn),有些甚至產(chǎn)生雜菌,給酸奶的風(fēng)味帶來很大的影響。為此,作者利用這兩種菌不同的生長特性,先將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌分離,再按(1~2)∶1的比例混合培養(yǎng)后用于制備酸奶發(fā)酵劑,可有效地解決這一問題。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 菌種、試劑與儀器

    保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌(生產(chǎn)發(fā)酵劑),由三色鴿乳業(yè)提供。

    鹽酸、NaOH、葡萄糖、酵母膏、溴甲酚綠、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,均為分析純;脫脂乳粉、乳粉水解液,均為食品級(jí)。

    YQX型厭氧培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋等。

    1.2 方法

    實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

    圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental process

    1.2.1 乳酸菌混合菌種的活化

    按1∶7(質(zhì)量體積比)的比例將脫脂乳粉和水配成復(fù)原牛奶600mL,加入15g蔗糖,充分混合,于80~85℃滅菌10~15min,然后冷卻至40℃,在無菌操作下,等量裝入3個(gè)250mL的錐形瓶中,接入5%的乳酸菌混合菌種,置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,取出,連續(xù)活化兩代后備用。

    1.2.2 乳酸菌混合菌的分離[4,5]

    乳酸菌混合菌分離培養(yǎng)基:牛肉膏1g,蛋白胨1g,酵母膏1g,葡萄糖1g,蕃茄汁20%,吐溫-80 0.05%,CaCO32g,瓊脂2g,蒸餾水100mL,pH 值6.5,于121℃滅菌20min,備用。

    取活化乳酸菌混合菌種1mL加入到9mL無菌水中,依次用10倍法稀釋至10-6;取各個(gè)稀釋度菌液1mL與已滅菌的培養(yǎng)基制成混合平板;將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa,保溫42℃,培養(yǎng)2~3d,挑選單個(gè)菌落,接種于液體培養(yǎng)基中,用無菌玻璃刮鏟依次涂布,或直接用接種環(huán)沾取原液,平板劃線分離,于40℃培養(yǎng)48h,如出現(xiàn)圓形稍扁平的淡黃色菌落且其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者,可初步定為乳酸菌。反復(fù)進(jìn)行3~5次純化,通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷乳酸菌純度,待確認(rèn)為純種后,再進(jìn)行鑒定、保存。

    1.2.3 保加利亞乳桿菌的分離與鑒定

    將BCP培養(yǎng)基的pH值用1%的鹽酸調(diào)至5.0,于121℃滅菌20min;無菌條件下倒平板凝固后,挑乳酸菌混合菌種劃平板,將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa,保溫42℃,培養(yǎng)48h,反復(fù)進(jìn)行3~5次純化,通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷保加利亞乳桿菌純度,待確認(rèn)為純種后,再進(jìn)行鑒定。

    1.2.4 嗜熱鏈球菌的分離與鑒定

    將BCP培養(yǎng)基的pH值用1%的NaOH調(diào)至9.0,于121℃滅菌20min,無菌條件下倒平板凝固后,挑乳酸菌混合菌種劃平板,將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa,保溫42℃,培養(yǎng)48h,反復(fù)進(jìn)行3~5次純化,通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷嗜熱鏈球菌純度,待確認(rèn)為純種后,再進(jìn)行鑒定。

    1.2.5 酸奶混合菌種的制備

    1.2.5.1 乳酸菌種的活化與計(jì)數(shù)

    活化培養(yǎng)基:脫脂乳粉13%,葡萄糖2%,乳粉水解液4%,酵母浸膏0.25%,溶劑為0.025mol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH=6.8)。

    選擇性培養(yǎng)基主要用于單菌分離,并非最適合生長培基。分別將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在活化培養(yǎng)基上于42℃活化6h,采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算酸乳中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量。

    1.2.5.2 液體菌種的混合

    取1mL桿菌活化液和12.5mL球菌活化液,混合,作為酸奶混合菌種。

    1.2.6 酸奶發(fā)酵劑的制備

    1.2.6.1 種子發(fā)酵劑的制備

    培養(yǎng)基:5mL 5%的石蕊液加入100mL脫脂乳(脫脂乳粉與5%蔗糖水以1∶10比例配制)移至250mL的三角瓶中。于121℃、0.15MPa滅菌20min。

    接種:在石蕊牛乳上接1mL酸奶混合菌種于42℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至液面呈紅色。

    1.2.6.2 母發(fā)酵劑的制備

    在250mL三角瓶中加入150mL脫脂乳(按1∶7的比例將脫脂乳粉和水配成復(fù)原牛奶,然后加入4g蔗糖)于121℃、0.15MPa滅菌20min,冷卻后用已滅菌的吸管吸取1mL凝塊,放入三角燒瓶中,攪拌后于42℃培養(yǎng)至酸度達(dá)0.8%~1.0%。

    1.2.6.3 工作發(fā)酵劑的制備

    將新鮮牛乳于90~95℃ 巴氏殺菌30~60min,冷卻至42~45℃,無菌條件下接種2%母發(fā)酵劑,培養(yǎng)4~6h,冷卻后熟即得菌種。

    將新鮮牛奶過濾,于95℃巴氏殺菌10min,冷卻至45℃,接種3%的上一步菌種,發(fā)酵4h,后熟12h,即得工作發(fā)酵劑。經(jīng)測(cè)定,其活力為0.85%。

    1.3 分析檢測(cè)

    1.3.1 活力測(cè)定[6]

    活力檢查:使用前在化驗(yàn)室對(duì)發(fā)酵劑的活力進(jìn)行檢查,依據(jù)發(fā)酵劑的酸生成狀況或色素還原情況進(jìn)行判斷(好的酸乳發(fā)酵劑活力一般在0.8%以上)。

    活力測(cè)定:在滅菌冷卻后的脫脂乳中加入3%的發(fā)酵劑,于37.8℃恒溫箱中培養(yǎng)3.5h,測(cè)定酸度,若滴定乳酸度達(dá)0.8%以上,認(rèn)為活力良好。

    1.3.2 乳酸菌計(jì)數(shù)

    采用血球板計(jì)數(shù)法[4]計(jì)算乳酸菌。

    1.3.3 乳酸菌的鏡檢[4,7]

    采用特殊的染色法——甲苯胺藍(lán)染色法,即涂片固定后,用0.2%的甲苯胺藍(lán)染色液染色2min,再用1%的乙酸溶液脫色數(shù)秒,即可使涂片中的菌體著染藍(lán)色,而且背景呈現(xiàn)白色或無色,菌體形狀十分清晰,即使涂片很厚且不勻也能看清菌體,便于菌體細(xì)胞計(jì)數(shù)和形體觀察。通過甲苯胺藍(lán)染色觀察分離培養(yǎng)的乳酸菌,根據(jù)乳酸菌的性質(zhì),看是否有其它雜菌,若有,挑取變?yōu)辄S色的菌落,繼續(xù)劃平板培養(yǎng),直到鏡檢全是乳酸菌為止。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基pH值的確定

    由于保加利亞乳桿菌在pH值為5或更低的情況下可生長、嗜熱鏈球菌在pH值較低的情況下不生長,為了確定乳桿菌能生長而鏈球菌不能生長的合適pH值,以保加利亞乳桿菌革蘭氏染色的鏡檢結(jié)果及菌落生長狀況為指標(biāo)進(jìn)行pH值單因素實(shí)驗(yàn)。挑取分離得到的乳酸菌菌落,接種到保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基中,于42℃厭氧培箱中培養(yǎng)48h,用革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢,結(jié)果見表1 。

    表1 保加利亞乳桿菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Tab.1 Microscopic examination results of Gram-staining for Lactobacillus bulgaricus

    由表1 可以看出,保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基的pH值為5.0時(shí),分離效果最佳。

    2.2 保加利亞乳桿菌性質(zhì)鑒定

    保加利亞乳桿菌菌落特征為:菌落呈中等大小,微白色,濕潤,邊緣不整齊,如棉絮團(tuán)狀。屬革蘭氏陽性桿菌,菌體寬度小于2μm,常表現(xiàn)出長桿狀,多呈線狀,常有卷曲,幼齡時(shí)單個(gè)或成對(duì)。符合文獻(xiàn)[8]對(duì)保加利亞乳桿菌形態(tài)的描述。

    將鑒定過的保加利亞乳桿菌接種到脫脂乳中,于不同溫度下培養(yǎng)發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn),保加利亞乳桿菌在39~44℃時(shí)約4h凝乳;當(dāng)培養(yǎng)溫度超過44℃時(shí),隨著溫度的升高,凝乳時(shí)間延長;當(dāng)培養(yǎng)溫度超過53℃時(shí),不能凝乳;當(dāng)培養(yǎng)溫度低于39℃時(shí),隨著培養(yǎng)溫度的降低,凝乳時(shí)間延長;當(dāng)培養(yǎng)溫度低于23℃時(shí),不能凝乳。

    分離到的桿菌在含膽汁酸鹽的液體培養(yǎng)基、含2%氯化鈉的液體培養(yǎng)基、含0.4%酚的培養(yǎng)基中均能生長,而在含0.5%酚的培養(yǎng)基中不能生長。進(jìn)一步證明,分離到的桿菌是保加利亞乳桿菌。

    2.3 嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基pH值的確定

    由于嗜熱鏈球菌在pH值為9.2的情況下能生長、保加利亞乳桿菌在pH值較高的情況下不生長,為了確定嗜熱鏈球菌能生長而保加利亞乳桿菌不能生長的合適pH值,以嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果及菌落生長狀況為指標(biāo)進(jìn)行pH值單因素實(shí)驗(yàn)。挑取分離得到的乳酸菌菌落,接種到嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基中,于42℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,用革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢,結(jié)果見表2 。

    表2 嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Tab.2 Microscopic examination results of Gram-staining of Streptococcus thermothillus

    由表2 可以看出,嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基的pH值為9.0時(shí),分離效果最佳。

    2.4 嗜熱鏈球菌性質(zhì)鑒定

    嗜熱鏈球菌菌落特征為:菌落光滑,微白色,邊緣整齊。屬革蘭氏陽性球菌,黃色,菌落較大,生長良好,菌落卵圓形,表面光滑,凸起,符合文獻(xiàn)[8]對(duì)嗜熱鏈球菌形態(tài)的描述。

    將分離得到的嗜熱鏈球菌接種到脫脂乳中,于不同溫度下培養(yǎng)發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn),嗜熱鏈球菌在39~46℃時(shí)約4h凝乳;在46~50℃時(shí),隨著溫度的升高,凝乳時(shí)間延長;當(dāng)培養(yǎng)溫度超過54℃時(shí),不能凝乳;當(dāng)培養(yǎng)溫度低于39℃時(shí),隨著培養(yǎng)溫度的降低,凝乳時(shí)間延長;當(dāng)培養(yǎng)溫度低于21℃時(shí),不能凝乳。

    分離到的球菌在含2%氯化鈉的液體培養(yǎng)基、0.1%的鎂藍(lán)牛乳中不能生長。進(jìn)一步證明,分離到的球菌是嗜熱鏈球菌。

    2.5 乳酸單菌與混合菌發(fā)酵酸乳品的性質(zhì)比較(表3 )

    表3 乳酸單菌及混合菌發(fā)酵的酸乳品性質(zhì)比較Tab.3 Performance comparison of yogurts fermented by Lactobacillus bulgaricus,Streptococcus thermothillus or their mixture

    由表3 可知,乳酸單菌發(fā)酵效果沒有球桿混合菌的效果好。

    2.6 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌配比的確定

    分別取活化后的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌1mL,用無菌水進(jìn)行10倍法均勻稀釋,取10-6、10-7、10-83種稀釋度,用混合平板法培養(yǎng),凝固后于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見表4。

    由表4可以看出,1mL活化菌懸液中,保加利亞乳桿菌的數(shù)量是嗜熱鏈球菌數(shù)量的25倍,因此在制發(fā)酵劑時(shí),可以取1mL桿菌活化液和25mL或12.5mL球菌活化液進(jìn)行混合,這樣混合制得的發(fā)酵劑中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例可以控制在(1~2)∶1之間。

    表4 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的平板計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.4 Count results of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermothillus

    2.7 工作發(fā)酵劑接種量的確定(表5 )

    表5 工作發(fā)酵劑接種量的確定Tab.5 Choose of inoculum amount of fermentation agent

    由表5 可以看出,工作發(fā)酵劑接種量以3%為佳,可以制得酸味適中、香味濃郁的酸乳制品。

    3 結(jié) 論

    (1)利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適pH值不同,確定了當(dāng)BCP培養(yǎng)基的pH值分別為5.0和9.0時(shí),能將兩者有效分離。

    (2)將分離開來的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按(1~2)∶1的比例混合制得酸奶發(fā)酵劑,以其作為乳酸菌菌種制得的酸乳品酸味適中、香味濃郁。

    [1]萬紅兵,田洪濤,山麗杰,等.嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌麥芽復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(6):51-55.

    [2]王俊英,張杰.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和性能研究[J].周口師范學(xué)院學(xué)報(bào),2012,29(2):89-91.

    [3]李志成,徐懷德,王敏,等.嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌增菌培養(yǎng)研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2002,(Z1):50-52.

    [4]凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:84-88.

    [5]趙麗麗.乳酸菌的分離鑒定及其在酸豆乳加工中的應(yīng)用[D].北京:北京工商大學(xué),2009.

    [6]袁麗紅.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:207-208.

    [7]昌加平.酸奶中乳酸菌鏡檢涂片的特殊染色法[J].微生物學(xué)通報(bào),1996,26(4):281-282.

    [8]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:371-385.

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