生物燃料生產(chǎn)中微生物的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制

曹小龍，田 云，盧向陽

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410028；2．湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙410028）

面對(duì)能源日益枯竭、環(huán)境不斷惡化、溫室效應(yīng)日趨嚴(yán)重等問題，綠色可持續(xù)發(fā)展的生物能源受到了廣泛重視，其中燃料乙醇被公認(rèn)為是最有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。木質(zhì)纖維素是燃料乙醇生產(chǎn)中最具潛力的原材料，其轉(zhuǎn)化生成生物燃料的過程主要分為3步：預(yù)處理、糖化和發(fā)酵，其中最重要也最困難的是糖化過程，即將致密的生物質(zhì)原材料分解為可發(fā)酵的還原性單糖。預(yù)處理方法主要有酸水解、堿水解、蒸汽爆破法、超聲波破碎法、氨纖維爆破法等。

預(yù)處理雖然可以很好地降低纖維素聚合度，但會(huì)產(chǎn)生很多對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，主要有以下3類：（1）弱酸，包括乙酸、甲酸、乙酰丙酸等；（2）呋喃醛類，主要是糠醛和羥甲基糠醛；（3）酚類化合物［1］。除了預(yù)處理過程產(chǎn)生的有毒物質(zhì)外，發(fā)酵產(chǎn)物的積累也會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生一定的毒害作用，最終降低生物燃料的產(chǎn)量。有機(jī)溶劑毒性主要體現(xiàn)在：提高了細(xì)胞膜的滲透性和流動(dòng)性，降低了能量轉(zhuǎn)移勢(shì)，破壞了膜蛋白的功能等等［2］。當(dāng)細(xì)胞膜的滲透性提高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)pH值控制受到影響，胞內(nèi)大分子（如RNA、磷脂和蛋白質(zhì)）向外滲透，嚴(yán)重威脅細(xì)胞的生長及存活；細(xì)胞膜流動(dòng)性的提高會(huì)改變其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，能量勢(shì)的降低則直接影響到各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有機(jī)溶劑的毒性大小與其極性密切相關(guān)，logP值在1～4之間的有機(jī)溶劑易溶于水，易進(jìn)入細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞危害極大［3］。

當(dāng)外界環(huán)境中存在有機(jī)溶劑時(shí)，非耐受菌細(xì)胞膜會(huì)遭到破壞，生理功能受到影響，甚至死亡，耐受菌則會(huì)作出相應(yīng)的改變來適應(yīng)這種環(huán)境［2］。微生物耐受性的研究，對(duì)生物燃料生產(chǎn)、生物醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境污染治理等都有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。作者在此重點(diǎn)介紹微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)制，包括細(xì)胞膜的改變與修飾、輸出泵的作用、熱激蛋白、轉(zhuǎn)化和降解等等。

1 細(xì)胞膜的改變與修飾

細(xì)胞膜作為屏障在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、保持細(xì)菌的正常代謝、在細(xì)胞與環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、能量交換和信息傳遞的過程中起著決定性的作用。研究表明，在微生物耐受性方面，細(xì)胞膜發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要機(jī)制有：脂肪酸飽和度的增加、脂肪酸極性頭部基團(tuán)的改變、不飽和脂肪酸的順反異構(gòu)變化、長鏈脂肪酸含量增加、新合成一些正常條件下不能合成的脂肪酸等。

1．1 脂肪酸飽和度的變化

飽和脂肪酸相對(duì)于不飽和脂肪酸有更高的相轉(zhuǎn)變溫度，因此，細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量以及酯?；脑黾樱梢蕴岣吣さ姆€(wěn)定性［4］。侯雪丹等［5］從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）出發(fā)，篩選獲得乙醇耐受菌株 Y－c－8和丙酮耐受菌株 B－g－5，分析發(fā)現(xiàn) Y－c－8中油酸和亞油酸含量從出發(fā)菌的19．24%和0%提高到了26．69%和48．90%，B－g－5中油酸和亞油酸含量分別高達(dá)21．87%和52．57%。楊潔等［6］用LC－MS方法分析乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母的總磷脂的變化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著酵母細(xì)胞由調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，含有不飽和長鏈的磷脂分子含量減少，含有飽和短鏈的磷脂分子含量顯著增加。Oh等［7］在Escherichia coli基因中敲除一個(gè)參與飽和脂肪酸降解和不飽和脂肪酸合成的基因fad的抑制基因fadR，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上各種飽和脂肪酸含量都大幅增加，耐受性也相應(yīng)地得到了提高。通常認(rèn)為：飽和脂肪酸的增加可以降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性，有利于細(xì)胞膜的穩(wěn)定，對(duì)提高細(xì)胞的耐受能力有很好的作用。但飽和脂肪酸的合成需要從頭開始，并且是一個(gè)耗能的過程［8］，因此，脂肪酸飽和度的改變，被認(rèn)為是一種微生物耐受有機(jī)溶劑的長期機(jī)制。另外，個(gè)別情況下，脂肪酸飽和度的增加提高了細(xì)胞的耐受性，但其乙醇產(chǎn)量并沒有相應(yīng)提高，說明耐受性和乙醇產(chǎn)量并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系［9］。

1．2 脂肪酸極性頭部基團(tuán)的變化

在革蘭氏陰性菌中，磷脂極性頭部基團(tuán)的種類和與之相連的脂肪酸長度都會(huì)影響到細(xì)胞膜的流動(dòng)性。脂肪酸的磷脂極性頭部基團(tuán)主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和心磷脂3種，且每一種的相轉(zhuǎn)變溫度不同，其中心磷脂的最高，在細(xì)胞膜中最穩(wěn)定。磷脂極性頭部基團(tuán)的改變?cè)赑．putida中比較普遍。溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E經(jīng)過甲苯耐受處理后，心磷脂含量從12%上升到25%，磷脂酰乙醇胺含量從78%下降到63%，磷脂酰絲氨酸含量基本保持不變，同位素示蹤法發(fā)現(xiàn)90%的32P整合到心磷脂中［10］。而且，有機(jī)溶劑的logP值越低，心磷脂的含量越高，磷脂酰乙醇胺的含量越低［11］。由此可以推斷，當(dāng)遭遇高有機(jī)溶劑環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜上磷脂中穩(wěn)定性高的極性基團(tuán)含量增加，穩(wěn)定性低的極性基團(tuán)含量減少，最終提高了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

1．3 不飽和脂肪酸的順反異構(gòu)變化

在細(xì)胞膜中，順式和反式不飽和脂肪酸以一定的比例存在著，而且順式不飽和脂肪酸的含量遠(yuǎn)大于反式脂肪酸。在順式不飽和脂肪酸中，雙鍵兩側(cè)的?；湂A角較大，使膜脂排列相對(duì)疏松；而在反式不飽和脂肪酸中，?；湂A角很小，細(xì)胞膜排列緊密、有序，有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以很好地阻止溶劑進(jìn)入膜內(nèi)。在有機(jī)溶劑刺激下，通過順反異構(gòu)酶（cti）的催化將不飽和脂肪酸由順式轉(zhuǎn)變?yōu)榉词剑梢越档图?xì)胞膜的流動(dòng)性和提高溶劑耐受性［2］。Bernal等通過熒光偏振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cti基因缺陷突變株的細(xì)胞膜致密性不及野生型，而且該基因是單順反子，在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的表達(dá)水平都比較低［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入甲苯后，溶劑耐受菌P．putida DOT－T1E在1min內(nèi)即發(fā)生順反異構(gòu)，與加入甲苯前相比，最終順反脂肪酸比例從7．5下降到了1［10］。

順反異構(gòu)是一個(gè)不需耗能的反應(yīng)，能夠迅速有效地進(jìn)行，因此，其很可能是細(xì)胞耐受機(jī)制中最先起反應(yīng)的過程。有人發(fā)現(xiàn)順反異構(gòu)現(xiàn)象在其它環(huán)境（如重金屬、高溫、低pH值等）下也普遍出現(xiàn)，說明這種機(jī)制可能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)脅迫的一般防御機(jī)制［11］。

2 輸出泵的作用

細(xì)胞膜作為細(xì)胞的第一道防御屏障，并不能阻擋所有的有機(jī)溶劑，當(dāng)溶劑進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的破壞作用，面對(duì)這種情況，耐受性微生物會(huì)通過與能量偶聯(lián)的輸出泵機(jī)制將胞內(nèi)的溶劑排出，保證其正常的生理環(huán)境，該現(xiàn)象普遍出現(xiàn)在革蘭氏陰性菌中。

輸出泵是能利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)將胞內(nèi)溶劑排出的膜蛋白，由3個(gè)功能不同的部分組成，內(nèi)膜蛋白負(fù)責(zé)底物識(shí)別和質(zhì)子逆轉(zhuǎn)運(yùn)，胞質(zhì)連接作為內(nèi)膜泵之間的橋梁，外膜蛋白作為輸出通道，三者缺一不可［2］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量功能各異的輸出泵，這些輸出泵能將包括丁醇、甲苯、苯乙烯、己烷、庚烷、辛烷、抗生素和其它烴類在內(nèi)的多種物質(zhì)排出胞外，并提高細(xì)菌的耐受性。當(dāng)前研究得最透徹的是RND家族（Resistance－nodulation－division family）的輸出泵，例如，P．putida DOTT1E的3個(gè)輸出泵（TtgABC、TtgDEF和TtgGHI）能有效地從細(xì)胞膜上泵出甲苯、苯乙烯、乙基苯和丙基苯4種溶劑［13］；來自大腸桿菌的輸出泵acrAB－tolC能夠?qū)⒓和椤⒏?、辛烷和壬烷等排出胞外?4］；任靜朝等［15］在志賀菌中也發(fā)現(xiàn)了輸出泵acrAB－tolC，并證實(shí)了該輸出泵能很好地將某些有機(jī)溶劑和抗生素排出胞外。

利用基因手段構(gòu)建工程菌，對(duì)于提高細(xì)菌的耐受性和燃料產(chǎn)量是非常有前景的。Dunlop等［16］利用生物信息學(xué)方法，在數(shù)據(jù)庫中發(fā)掘到了43個(gè)輸出泵基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，用7種常見的有機(jī)溶劑分別測(cè)試其耐受性，發(fā)現(xiàn)43株工程菌對(duì)丁醇和異戊醇的耐受性都沒改變，而對(duì)其它5種（Geranyl acetate，Geraniol，α－Pinene，Limonene，F(xiàn)arnesyl hexanoate）有機(jī)溶劑的耐受性均有顯著提高，且生物燃料產(chǎn)量也大幅提高。

3 熱激蛋白

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSP）也被稱作分子伴侶，是細(xì)胞在外界物理化學(xué)刺激下產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，在胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和降解過程中起重要作用［17］。按照蛋白的大小，可分為5類，分別為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱激蛋白［18］。熱激蛋白最先是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，受熱刺激后合成量顯著增加，之后，發(fā)現(xiàn)其還能受溶劑、紫外線、機(jī)械損傷等誘導(dǎo)。

熱激蛋白在溶劑脅迫下，能夠阻止蛋白質(zhì)聚集，并協(xié)助其重新折疊，并最終提高耐受性［2］。目前，已經(jīng)在大腸桿菌、乳球桿菌、芽孢桿菌、假單胞菌、釀酒酵母等微生物中發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白的存在，而且不斷有人通過基因工程手段將熱激蛋白基因轉(zhuǎn)入溶劑生產(chǎn)菌中成功構(gòu)建溶劑耐受菌。Tomas等［19］發(fā)現(xiàn)熱激蛋白Gro－ESL過表達(dá)可以降低丁醇對(duì)C．a(chǎn)cetobutylicum的抑制，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)GroESL過表達(dá)可以引起一系列熱激蛋白基因（包括dnaKJ、hsp18、hsp90）表達(dá)的提高。Zingaro等［20］在大腸桿菌中插入熱激蛋白基因構(gòu)建各種半合成脅迫應(yīng)答系統(tǒng)，同時(shí)超表達(dá)熱激蛋白GrpE和GroESL后，工程菌在5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇中24h后的活力是出發(fā)菌的3倍；同時(shí)超表達(dá)GroESL和ClpB共存質(zhì)粒后，工程菌在5%乙醇、1%正丁醇和1%異丁醇中24h后的活力較出發(fā)菌分別提高了1130%、78%和25%；同時(shí)超表達(dá)GrpE、Gro－ESL和ClpB的單質(zhì)粒后，工程菌在7%乙醇、1%正丁醇和25%1，2，4－丁三醇中24h后的活力較出發(fā)菌分別提高了200%、390%和78%。這些均表明熱激蛋白在微生物耐受性方面發(fā)揮著巨大的作用。

熱激蛋白基因的表達(dá)往往受特定的轉(zhuǎn)錄因子和σ因子的調(diào)控，其中最重要的是革蘭氏陰性菌中的σB和芽孢桿菌中的σS，但其具體調(diào)控機(jī)制還不清楚［17］。總的來說，熱激蛋白可以通過修復(fù)損傷蛋白質(zhì)而起到提高細(xì)胞耐受性對(duì)抗細(xì)胞死亡的作用，并且能有效提高生物燃料產(chǎn)量。

4 轉(zhuǎn)化與降解

在有毒溶劑進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞還會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的酶系，將有毒溶劑降解為低毒或無毒的小分子物質(zhì)，排出胞外或加以利用。P．putida DOT－T1E可以在90%（體積分?jǐn)?shù)）的甲苯培養(yǎng)基中生存，主要是因?yàn)榘麅?nèi)甲苯雙加氧酶將甲苯氧化成了3－甲基兒茶酚，并最終進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，通過降解甲苯，消除抑制作用，從而維持正常的生理代謝［12］。最近，Dai等［21］在 Clostridium acetobutylicumRh8菌株基因組中插入一個(gè)來自ClostridiumbeijerinckiiNRRL B593的次級(jí)醇脫氫酶基因（sADH），由thl啟動(dòng)子控制，發(fā)現(xiàn)該基因過表達(dá)后，Rh8的醇耐受性顯著提高，而且在以31．42%葡萄糖發(fā)酵過程中，總醇的產(chǎn)量也提高至23．88g·L－1（異丙醇7．6g·L－1、丁醇15g·L－1、乙醇1．28g·L－1）。這表明，相應(yīng)的降解酶系可以提高微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受能力，并最終提高生物燃料的產(chǎn)量，同時(shí)，也證明了基因工程手段在提高微生物耐受性的應(yīng)用中意義重大。

5 其它耐受機(jī)制

除了以上這些研究得較多的耐受機(jī)制外，耐受微生物中還存在一些報(bào)道較少的機(jī)制，像比表面積的改變、囊泡外排、脂多糖等。Neumann等［22］報(bào)道耐受菌P．putida P8在芳香族化合物（如苯酚、4－氯苯酚）存在時(shí)，其細(xì)胞體積明顯增大，且溶劑濃度越大，體積變化越顯著，同樣的情況在Enterobacter sp．VKG H12遇到正丁醇時(shí)也能觀察到。這說明，在遇到溶劑脅迫時(shí)，細(xì)胞能夠通過降低其比表面積以減少溶劑對(duì)胞體的傷害。另外，Kobayashi等［23］發(fā)現(xiàn) P．putida IH－2000在加有甲苯的培養(yǎng)基上生長時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的囊泡，且囊泡會(huì)從細(xì)胞膜上釋放出來，囊泡中的甲苯濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞膜上的甲苯濃度，說明該菌通過形成囊泡將胞內(nèi)的有毒溶劑排出胞外。

微生物體內(nèi)存在多種耐受機(jī)制，這些機(jī)制往往不是單獨(dú)起作用，而是多種機(jī)制共同作用以應(yīng)付復(fù)雜的生存環(huán)境。Sandoval等［24］分別取有機(jī)溶劑存在時(shí)和不存在時(shí)的大腸桿菌基因組構(gòu)建文庫，分析后發(fā)現(xiàn)一系列與細(xì)胞膜和胞外進(jìn)程相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了變化，并產(chǎn)生特異的氨基酸和核苷酸，表明耐受性涉及多條途徑。多種耐受機(jī)制的存在，使細(xì)胞對(duì)溶劑的耐受性大大提高，保持了菌株的活性，一定程度上也提高了生物燃料的終產(chǎn)量。

6 結(jié)語

在生物燃料的生產(chǎn)過程中，產(chǎn)物的積累會(huì)抑制微生物和酶的活性，并最終影響其產(chǎn)量，應(yīng)對(duì)措施主要有兩個(gè)方面：一是及時(shí)從反應(yīng)器中除去產(chǎn)物以解除抑制作用，其方法主要包括氣提、液提、滲透蒸發(fā)、滲透萃取等；二是通過菌種篩選、菌種馴化、誘變、基因改造等方法提高菌種的耐受能力，使之能在高濃度的有機(jī)溶劑條件下正常生長。微生物的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制多種多樣，主要分為通過細(xì)胞膜的防御作用阻止毒性溶劑的進(jìn)入、通過輸出泵將已經(jīng)進(jìn)入胞內(nèi)的溶劑排出、通過胞內(nèi)降解酶系將未能及時(shí)排出的有毒溶劑分解等三個(gè)方面，因此，提高微生物有機(jī)溶劑耐受性的方法也可以從針對(duì)這三個(gè)方面著手，包括從高濃度溶劑污染的自然環(huán)境中篩選耐受菌，在宿主菌株中轉(zhuǎn)入相應(yīng)的熱激蛋白基因、輸出泵基因、高耐受性脂肪酸膜基因等以構(gòu)建新的高耐受性的工程菌等。

有機(jī)溶劑對(duì)微生物的作用并非絕對(duì)的，研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)臐舛认?，有機(jī)溶劑也能促進(jìn)微生物的生長，并最終提高生物燃料產(chǎn)量。例如，法尼烯等生化柴油和脂肪酸衍生物燃料在適當(dāng)?shù)臐舛认虏粫?huì)抑制細(xì)胞的生長［2］；在釀酒酵母乙醇發(fā)酵過程中，低濃度的弱酸（＜100mmol·L－1）甚至可以提高乙醇得率，而在高于這一濃度時(shí)，乙醇得率則會(huì)降低［25］。

高有機(jī)溶劑耐受能力的菌株在生物燃料生產(chǎn)、生物修復(fù)、生物醫(yī)藥、污水處理、酶制劑開發(fā)、全細(xì)胞生物催化等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，但溶劑輸出泵的具體作用機(jī)制、革蘭氏陽性菌的耐受機(jī)制等相關(guān)研究都還需要進(jìn)一步的深入。

［1］李洪興，張笑然，沈煜，等．纖維素乙醇生物加工過程中的抑制物對(duì)釀酒酵母的影響及應(yīng)對(duì)措施［J］．生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（9）：1321－1328．

［2］Dunlop M J．Engineering microbes for tolerance to next－generation biofuels［J］．Biotechnology for Biofuels，2011，4（1）：32．

［3］de Bont J A M．Solvent－tolerant bacteria in biocatalysis［J］．Trends in Biotechnology，1998，16（12）：493－499．

［4］Heipieper H J，Neumann G，Cornelissen S，et al．Solvent－tolerant bacteria for biotransformations in two－phase fermentation systems［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2007，74（5）：961－973．

［5］侯雪丹，吳培，張毅，等．有機(jī)溶劑耐受性酵母細(xì)胞的脂肪酸組成分析［J］．現(xiàn)代食品科技，2009，25（5）：573－576．

［6］楊潔，丁明珠，李炳志，等．乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母的磷脂組變化［J］．化工學(xué)報(bào)，2012，63（6）：1830－1835．

［7］Oh H Y，Lee J O，Kim O B．Increase of organic solvent tolerance of Escherichia coli by the deletion of two regulator genes，fadR and marR［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2012，96（6）：1619－1627．

［8］Isken S，Heipieper H J．Encyclopedia of Environmental Microbiology：Toxicity of Organic Solvents to Microorganisms［M］．New York：Wiley，2002：3147－3155．

［9］Baer S H，Blaschek H P，Smith T L．Effect of butanol challenge and temperature on lipid composition and membrane fluidity of butanol－tolerant［J］．Appl Environ Microbiol，1987，53（12）：2854－2861．

［10］王鑫昕，王少華，李維，等．細(xì)菌的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制［J］．生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（5）：641－649．

［11］王慶利，何丹，鄭曉冬，等．有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害及細(xì)胞的耐受性機(jī)制［J］．微生物學(xué)報(bào)，2002，29（4）：81－85．

［12］Udaondo Z，Duque E，F(xiàn)ernández M，et al．Analysis of solvent tolerance in Pseudomonas putida DOT－T1Ebased on its genome sequence and a collection of mutants［J］．FEBS Letters，2012，586（18）：2932－2938．

［13］Segura A，Duque E，Mosqueda G，et al．Multiple responses of Gram－negative bacteria to organic solvents［J］．Environ Microbiol，1999，1（3）：191－198．

［14］Takatsuka Y，Chen C，Nikaido H．Mechanism of recognition of compounds of diverse structures by the multidrug efflux pump AcrB of Escherichia coli［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（15）：6559－6565．

［15］任靜朝，段廣才，宋春花，等．志賀菌主動(dòng)外排泵acrAB－tolC及調(diào)控基因marOR突變與耐藥的關(guān)系［J］．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，36（1）：45－48．

［16］Dunlop M J，Dossani Z Y，Szmidt H L，et al．Engineering microbial biofuel tolerance and export using efflux pumps［J］．Molecular Systems Biology，2011，7：487．

［17］Nicolaou S A，Gaida S M，Papoutsakis E T．A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing：From biofuels and chemicals，to biocatalysis and bioremediation［J］．Metabolic Engineering，2010，12（4）：307－331．

［18］Kim K K，Kim R，Kim S H．Crystal structure of a small heatshock protein［J］．Nature，1998，394（6693）：595－599．

［19］Tomas C A，Welker N E，Papoutsakis E T．Overexpression of groESLin Clostridium acetobutylicumresults in increased solvent production and tolerance，prolonged metabolism，and changes in the cell′s transcriptional program［J］．Appl Environ Microbiol，2003，69（8）：4951－4965．

［20］Zingaro K A，Papoutsakis E T．Toward a semisynthetic stress response system to engineer microbial solvent tolerance［J］．MBio，2012，3（5）：1－9．

［21］Dai Z，Dong H，Zhu Y，et al．Introducing a single secondary alcohol dehydrogenase into butanol－tolerant Clostridium acetobutylicumRh8switches ABE fermentation to high level IBE fermentation［J］．Biotechnology for Biofuels，2012，5（1）：44．

［22］Neumann G，Veeranagouda Y，Karegoudar T B，et al．Cells of Pseudomonas putida and Enterobacter sp．a(chǎn)dapt to toxic organic compounds by increasing their size［J］．Extremophiles，2005，9（2）：163－168．

［23］Kobayashi H，Uematsu K，Hirayama H，et a1．Novel toluene elimination system in a toluene－tolerant microorganism ［J］．Journal of Bacteriology，2000，182（22）：6451－6455．

［24］Sandoval N R，Mills T Y，Zhang M，et al．Elucidating acetate tolerance in E．coli using agenome－wide approach［J］．Metabolic Engineering，2011，13（2）：214－224．

［25］Larsson S，Palmqvist E，Hahn－Hgerdal B，et al．The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood［J］．Enzyme and Microbial Technology，1999，24（3－4）：151－159．