大孔樹脂法分離純化阿維菌素工藝研究

逯凱霄，王棟良，李學(xué)紅，劉書琴

（華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司，河北 石家莊052165）

阿維菌素（Avermectin）是由灰黃鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的帶雙糖支鏈的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1］，由一組結(jié)構(gòu)相近的 A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b等8個(gè)同系物組成，其中阿維菌素B1a的生物活性最高，含量大于90%[2］。

阿維菌素首先由日本北里大學(xué)和美國(guó)Merck公司開發(fā)為具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的殺蟲劑[3］，由于其作用機(jī)制獨(dú)特，對(duì)害蟲具有觸殺和胃毒作用[4］，對(duì)人畜安全，具有高選擇性和高安全性，是當(dāng)前生物農(nóng)藥市場(chǎng)中最受歡迎和具有競(jìng)爭(zhēng)性的新產(chǎn)品，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)部推薦的高毒農(nóng)藥的首選替代品種之一。

目前，我國(guó)阿維菌素制劑的年產(chǎn)量已達(dá)萬(wàn)噸，是微生物農(nóng)藥中年產(chǎn)值最大的品種[5］。但目前采用的分離方法一般為溶媒提取結(jié)晶法[6］，溶劑用量及損耗量大，生產(chǎn)成本高，成為阿維菌素類產(chǎn)品持續(xù)發(fā)展的瓶頸。作者首次采用大孔樹脂對(duì)阿維菌素進(jìn)行分離純化，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

阿維菌素發(fā)酵液、雙蒸水，自制；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；大孔樹脂D312、HZ816、HZ801，上海華震科技有限公司；大孔樹脂 D101、LX－11、AB－8，西安藍(lán)曉科技有限公司；大孔樹脂 Amberlite XAD1600，美國(guó)羅門哈斯公司；乙腈（色譜純），美國(guó)Merck公司；工業(yè)乙醇，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀（996檢測(cè)器，515泵），Waters公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司；TGL－16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－水 （90︰10，體積比）；流速：1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；進(jìn)樣量：10μL。阿維菌素保留時(shí)間為9.5min。

精密稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品5mg置于50mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解；再精密移取該溶液5mL置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL注入色譜儀，采用外標(biāo)法按上述色譜條件測(cè)定。該方法在阿維菌素濃度為0.25～25 μg· mL－1范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系（R＝0.9999）；加標(biāo)回收率（n＝5）為100.8%，RSD為0.89%。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液預(yù)處理及阿維菌素的提取

阿維菌素主要存在于菌絲體內(nèi)，為了提高固液分離時(shí)的過(guò)濾速度，在發(fā)酵液中按3∶100（g∶mL）加入珍珠巖，攪拌30min后真空抽濾，水頂洗，得阿維菌素菌絲體。

向阿維菌素菌絲體中按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇后攪拌浸提1h，過(guò)濾，得1次浸提液；向浸提后的菌絲體中再按2∶1（mL∶g）加入95%乙醇，攪拌浸提1h，過(guò)濾，得2次浸提液；合并浸提液，浸提收率為95.21%（n＝3）；50℃下減壓濃縮浸提液至乙醇濃度為50%，待上大孔樹脂柱。

1.3.2 樹脂吸附和解吸

1.3.2.1 樹脂的預(yù)處理及再生

樹脂預(yù)處理方法：用95%乙醇充分浸泡樹脂1～2次，除去致孔劑，用水反復(fù)洗滌至洗滌液無(wú)乙醇?xì)馕?；?mol·L－1鹽酸浸泡樹脂4h，水洗至中性；再用2 mol·L－1氫氧化鈉溶液攪拌浸泡4h，水洗至中性后，用50%乙醇平衡，備用。

樹脂再生方法與預(yù)處理基本相同。

1.3.2.2 樹脂的篩選

根據(jù)阿維菌素的脂溶特性，選用非極性樹脂D312、HZ816、D101、LX－11、XAD1600及中等極性樹脂HZ801、AB－8共7種型號(hào)大孔樹脂作為吸附載體，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附篩選。分別取預(yù)處理好的上述樹脂各100mL，重力沉降法裝柱，上端加入濃縮后的阿維菌素浸提液，流速為200mL·h－1，HPLC在線檢測(cè)，當(dāng)流出液中阿維菌素含量為上樣液含量的10%時(shí)，樹脂吸附飽和，停止上樣，計(jì)算吸附容量。

1.3.2.3 吸附流速的選擇

將等體積濃縮后的阿維菌素浸提液分別以50mL·h－1、100mL·h－1、150mL·h－1、200mL·h－1、250mL·h－1、300mL·h－1的流速通過(guò) HZ816樹脂柱吸附，HPLC檢測(cè)流出液中阿維菌素含量。

1.3.2.4 洗脫溶劑的選擇

選用等體積甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇等4種溶劑，對(duì)飽和HZ816樹脂進(jìn)行解吸，HPLC檢測(cè)解吸液中阿維菌素的含量，考察洗脫溶劑對(duì)解吸收率的影響。

1.3.2.5 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇

取100mL飽和HZ816樹脂用50%乙醇洗滌后，再用不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，洗脫速度50 mL·h－1，HPLC在線檢測(cè)，考察洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)B1a含量、解吸收率的影響。

1.3.3 結(jié)晶

合并洗脫液中B1a含量大于90%部分，減壓濃縮至無(wú)乙醇流出后，加入95%乙醇至結(jié)晶液中，阿維菌素濃度為10mg·mL－1，45℃下加熱溶解，5℃下放置8h，過(guò)濾，再于5℃下用乙醇洗滌濾餅，真空干燥，得到白色阿維菌素粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果

考察了7種大孔樹脂對(duì)阿維菌素的動(dòng)態(tài)吸附量，結(jié)果見圖1。

圖1 不同型號(hào)大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附量的比較Fig.1 Comparison of dynamic adsorption capacity for different macroporous resins

由圖1可以看出，大孔樹脂HZ816具有最佳吸附性能，動(dòng)態(tài)吸附量達(dá)到62mg·mL－1。因此，選擇大孔樹脂HZ816作為阿維菌素的吸附載體。

2.2 吸附流速的選擇

不同吸附流速下HZ816樹脂的阿維菌素吸附率見圖2。

圖2 上樣液吸附流速對(duì)HZ816樹脂吸附性能的影響Fig.2 Effect of flow rate of sample solution on adsorption performance of resin HZ816

由圖2可以看出，吸附流速越慢，HZ816樹脂的阿維菌素吸附率越高；但吸附流速過(guò)慢會(huì)延長(zhǎng)產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)成本。綜合考慮，選擇150～200 mL·h－1（1.5～2BV·h－1）作為吸附流速。

2.3 洗脫溶劑的選擇

采用4種不同洗脫溶劑，HZ816樹脂的解吸收率見圖3。

由圖3可以看出，乙醇具有較好的解吸能力。因此選擇乙醇作為洗脫溶劑。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫時(shí)，阿維菌素解吸收率和B1a含量見表1 。

圖3 不同洗脫溶劑的HZ816樹脂解吸收率Fig.3 The desorption yield of resin HZ816with different eluents

表1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫對(duì)阿維菌素解吸收率和B1a含量的影響Tab.1 Effect of different volume fractions of ethanol on yield and B1acontent of avermectin

由表1 可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于90%時(shí)，解吸收率較高，但由于阿維菌素洗脫過(guò)快，色譜峰與雜質(zhì)峰不能有效分離；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于90%時(shí)，雖然B1a含量較高，但解吸拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，洗脫體積明顯增加。因此，選擇90%乙醇為洗脫劑，阿維菌素分離效果好，洗脫速度快。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇大孔樹脂HZ816作為吸附載體，在吸附流速為1.5～2BV·h－1、90%乙醇作為洗脫劑的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，平均解吸收率大于90%、阿維菌素中B1a含量大于91%、總收率大于65%。表明大孔樹脂有效地摒棄了浸提液中的色素和大極性雜質(zhì)，提高了解吸液的質(zhì)量，而且具有較高的吸附率和解吸率，為下游結(jié)晶工序打下基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

研究了大孔樹脂法分離純化阿維菌素的方法。選擇大孔樹脂HZ816作為吸附樹脂，在吸附流速為1.5～2BV·h－1、90%乙醇作為洗脫劑的優(yōu)化條件下，解吸收率大于90%、阿維菌素中B1a含量大于91%、總收率大于65%。該方法工藝簡(jiǎn)單、分離效果好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Burg R W，Miller B M，Baker E E，et al.Avermectins，a new family of potent anthelmintic agents：Producing organism and fermentation[J］.Antimicrob Angents Chemother，1979，15（3）：361－367.

[2]Pozo O J，Marin J M，Sancho J V，et al.Determination of abamectin and azadirachtin residues in orange samples by liquid chromatography－electrospray tandem mass spectrometry[J］.Journal of Chromatography A，2003，992（1－2）：133－140.

[3]Lasota J A，Dybas R A.Avermectins，a novel class of compounds：Implications for use in arthropod pest control[J］.Annu Rev Entomol，1991，36：91－117.

[4]呂淑君.阿維菌素的生物合成[J］.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1997，18（2）：114－118.

[5]朱昌雄，孫東園，蔣細(xì)良.我國(guó)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)業(yè)化對(duì)策建議[J］.現(xiàn)代化工，2004，24（3）：6－11.

[6]宋淵.阿維菌素的工業(yè)化生產(chǎn)研究[J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2002，10（21）：57－59.