產氣莢膜梭菌α毒素分子生物學研究進展

張艷平，唐成程，許崇波

1.大連大學 a.生命科學與技術學院；b.醫(yī)學院；遼寧 大連 116622；2.吉林大學 畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一，該菌的致病因子是其所產生的外毒素。迄今，已發(fā)現的產氣莢膜梭菌外毒素有12種（α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν）之多，但起主要致病作用的只有4種（α、β、ε和ι），據此將該菌分為A、B、C、D、E等5個毒素型。各型產氣莢膜梭菌均產生α毒素（C.perfringens alpha-tox?in，CPA），它是產氣莢膜梭菌最重要的致病毒素之一[1-2]，國內外學者對產氣莢膜梭菌α毒素進行了大量的研究，并取得了一些研究成果。在此，我們對產氣莢膜梭菌α毒素的生物學特性、基因克隆與轉錄調控、基因表達與基因融合、基因定點突變與結構分析、N端和C端的結構與功能等方面的研究進展進行簡要綜述。

1 生物學特性

α毒素是一種多功能性金屬酶，具有磷脂酶C（PLC）和鞘磷脂酶（SMase）等2種酶活性，能同時水解磷脂酰膽堿和鞘磷脂。α毒素依靠這2種酶活性，水解組成細胞膜的主要成分膜磷脂，破壞細胞膜結構的完整性，導致細胞裂解，從而具有細胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。α毒素的溶血活性具有冷熱溶血效應（hot-cold hemolysis），即α毒素在37℃與紅細胞作用時，紅細胞并不發(fā)生裂解，只有當紅細胞變冷至4℃時才會發(fā)生裂解。已在小鼠、家兔、綿羊等紅細胞上發(fā)現了α毒素的這種冷熱溶血效應[3]。α毒素可被EDTA、鄰二氮雜菲可逆性抑制，還可被乙醚偶聯的磷脂酰膽堿抑制。去污劑可增加α毒素活性，這是由于磷脂或甘油二酯的可溶性，而不是由于去污劑對蛋白質的作用。α毒素對胰酶敏感，2.5%的胰酶與α毒素于37℃作用1 h，即可使其完全失活[4]。此外，Titball等報道[5]，當把α毒素加熱至60～70℃時就可以使其失去活性，而當進一步加熱到100℃時，又可以恢復部分生物學活性。

2 基因克隆與轉錄調控

α毒素基因位于染色體上，其結構基因大小為1194 bp，編碼的產物由398個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為45.5×103。其中信號肽為28個氨基酸殘基，其余370個殘基構成的成熟肽的相對分子質量約為43×103。α毒素編碼區(qū)G+C含量為34%，SD序列為CGGGGG，-10區(qū)序列為TATAAT，-35區(qū)序列為GTGAGG，終止密碼子為2個連在一起的TAA。Katayama等[6]比較了A型和C型產氣莢膜梭菌α毒素的基因序列，證實二者有18個堿基不同，結果導致6個氨基酸殘基不同，其他部分相同。雖然A型菌α毒素成熟肽與C型菌α毒素成熟肽有6個氨基酸殘基的不同，但卻具有相同的磷脂酶C活性和溶血活性。Effat等[7]比較了5株A型菌株、1株B型菌株、1株C型菌株、2株D型菌株和1株E型菌株的α毒素的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列，在1194 bp編碼區(qū)里，不同菌株之間平均有1.3%的核苷酸序列不同，有1.2%的氨基酸序列不同，但并不影響α毒素本身的活性，各型菌株產生的α毒素具有相同的生物學功能。

Sakurai等[8]報道，5種毒素型產氣莢膜梭菌的α毒素的產量是不同的，甚至同一種毒素型產氣莢膜梭菌在不同生長時期的α毒素的產量亦不同[8]。Toy?onaga等[9]研究證實α毒素的產量是在轉錄水平上調控的，他們將啟動子-35區(qū)上游富含A+T序列缺失0.7 kb，結果α毒素的表達量增加10倍，表明該區(qū)在基因表達時呈負調控作用。核苷酸序列分析證明，在α毒素基因上游-66～-40間存在3個周期性重復的（dA）5-6序列，當缺失含2個（dA）5-6區(qū)的77 bp片段時，α毒素表達量異常增加。這些實驗結果充分說明了α毒素啟動子上游的基因序列對α毒素基因的轉錄呈負調控作用，這種調控作用可能是由于該區(qū)DNA扭曲的潛在影響。Katayama等[6]報道，在相同培養(yǎng)條件下，A型菌株比C型菌株的mRNA含量高23倍。另外還證實，A型產氣莢膜梭菌菌株中含有特異的DNA結合蛋白，如果將α毒素基因分成3個片段A、B和C，A型和C型菌株都含有特異結合片段A的特異DNA結合蛋白，只有A型菌株含有特異結合片段B的特異DNA結合蛋白，這種特異DNA結合蛋白可能是A型菌株α毒素產量高于C型菌株的一個因素。Tsutsui等[10]報道，α毒素高產毒菌株A型產氣莢膜梭菌NCTC8237和PB6K的mRNA含量比低產毒菌株B、C、D型的mRNA含量高40倍左右。從上述這些實驗結果可以推測，α毒素的產量可能是像多數原核生物一樣是在轉錄水平上調控的。

3 基因表達與基因融合

α毒素的啟動子是最強的啟動子之一，可被大腸桿菌的RNA聚合酶所識別，因而α毒素在自身啟動子下不僅可在產氣莢膜梭菌本身中高效表達，也可在大腸桿菌中得到高效表達。此外，也可將其置于其他啟動子下，轉化大腸桿菌后獲得高效表達。許崇波等[11]利用PCR技術，從A型產氣莢膜梭菌標準株染色體DNA中擴增出α毒素基因，構建了含α毒素基因的重組大腸桿菌BL21（DE3）（pXETA02）。經酶切鑒定和測序證實，構建的表達質粒pXETA02含有α毒素基因序列。經SDS-PAGE、Western印跡分析和ELISA檢測，重組菌株表達的α毒素能夠被α毒素單抗識別。以IPTG為誘導劑，優(yōu)化表達條件后，α毒素的表達量占菌體總蛋白的34.83%。以乳糖為誘導劑，優(yōu)化表達條件后，α毒素的表達量占菌體總蛋白的23.82%。動物實驗結果表明，用重組α毒素免疫的小鼠可以抵抗1 MLD的A型產氣莢膜梭菌標準株C57-1毒素攻擊。

許崇波等[12-14]進行了α-β2-β1抗原基因融合、表達及其免疫原性研究。首先，從C型產氣莢膜梭菌染色體基因組中擴增了1.2 kb的α毒素基因、0.95 kb的β1毒素基因、0.72 kb的β2毒素基因，酶切回收的3種毒素基因片段分別插入表達載體pET-28c，構建了3種重組質粒pETXA1、pETXB1、pETXB2，構建了α-β1毒素融合基因重組質粒 pETXAB1、β1-β2毒素融合基因重組質粒pETXB1-2和α-β2-β1融合基因重組質粒pXETAB2B1。以IPTG為誘導劑誘導重組菌株表達的優(yōu)化條件是:培養(yǎng)基pH7.5，培養(yǎng)溫度37℃，IPTG濃度0.4 mmol/L，菌體生長密度D600nm達到1.0時加入IPTG，誘導5 h，此時α-β2-β1融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的22%。α-β2-β1融合基因表達產物的Western印跡結果表明，在相對分子質量約95×103處出現C型產氣莢膜梭菌抗血清的識別條帶，表明α-β2-β1融合蛋白可以被特異性抗體識別。生物學功能測定和動物安全性試驗證實重組菌株無致病性，十分安全。免疫原性研究表明，α-β2-β1融合蛋白具有良好的免疫原性和中和α、β1、β2毒素活性的能力，為今后從事產氣莢膜梭菌基因工程亞單位疫苗奠定了良好的工作基礎。

4 基因定點突變與結構分析

α毒素的氨基酸組成對其生物學功能有著重要的影響，其中個別氨基酸對其生物活性起著十分重要的作用[15]。Guillouard等[16-17]將56位的天門冬氨酸突變成絲氨酸、天門冬酰氨、谷氨酸或谷氨酰氨之后，突變的毒素完全喪失了α毒素的溶血活性、磷脂酶C活性和鞘磷脂酶活性。當130位的天門冬酰氨發(fā)生突變后，突變毒素活性只有天然毒素的約1/100，同時還證實，56位的天門冬酰氨對α毒素的酶催化作用是必需的，而130位天門冬酰氨對其結構的維持是必需的。盡管上述不同位點的氨基酸發(fā)生突變之后，對α毒素的生物學活性有著不同程度的影響，甚至可使其生物活性完全喪失，但仍然保持著天然毒素的部分或全部抗原性。

Nagahama等[18]利用定點突變技術，研究了組氨酸殘基在α毒素中的作用。他們將第68位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，結果突變的α毒素完全喪失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性。如果將第126位、136位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，突變的α毒素活性只有天然α毒素活性的1/100。如果將第46、207、212、241位組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，結果突變的α毒素活性和天然α毒素活性相比沒有什么變化，這表明上述4個位置的組氨酸殘基對α毒素具有生物活性不是必需的。Nagaham等[19]證實，74位的酪氨酸也是一個對α毒素的生物學活性起著重要作用的關鍵氨基酸殘基，當其被突變置換后，可使其生物學活性降低至1/250。作者還研究了N端酶活位點附近57位和65位酪氨酸的作用，將以上位點用丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸突變后，沒有影響鞘磷脂酶的活性，然而丙氨酸和亮氨酸突變體在羊紅細胞中的溶血性和對脂質體的結合都顯著降低。將2個突變體毒素結合到脂質體上，并用環(huán)境敏感熒光基團標記后追蹤，發(fā)現其存在于雙分子層疏水區(qū)。以上實驗證實57位和65位酪氨酸殘基對α毒素滲透進雙分子膜和鞘磷脂催化位點過程起著重要作用，但不參與酶活反應。Na?gahama等[20]將152位的谷氨酸突變成甘氨酸或谷氨酰氨后，其生物學活性完全喪失，但當用天門冬酰氨置換后則不能完全喪失這些活性。上述位點氨基酸的突變并不影響α毒素與綿羊紅細胞的結合及從溶液中吸收游離鋅離子的特性。Alape-Giro等[21]將α毒素結合鈣離子的269位和336位天冬氨酸殘基突變?yōu)樘於０泛?，其溶血活性下降?0%，細胞毒性降低至1/1000。實驗結果還證實體內鞘磷脂酶活性和C端區(qū)域對于體內肌肉毒性是非常重要的，上述突變體毒素肌肉毒性相比野生型減少了12%。因此，該實驗解釋了所研究的氨基酸殘基對于產氣莢膜梭菌磷脂酶C毒性的重要性。

許崇波等[22]對A型產氣莢膜梭菌α毒素第68位組氨酸突變體及其結構進行了研究。他們將A型產氣莢膜梭菌α毒素（CPA）第68位組氨酸（CAT）定點突變成甘氨酸（GGT），構建了含CPA突變基因表達質粒的重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），其表達量占菌體總蛋白的31.65%。應用EXPASY服務器（http://www.expasy.org/tools）的 SOPMA 法對CPA和CPA-His68Gly突變體分子進行2級結構預測，結果顯示CPA蛋白含有118個α螺旋、78個β折疊、44個β轉角、130個無規(guī)則卷曲，CPA-His68Gly突變體含有118個α螺旋、79個β折疊、45個β轉角、128個無規(guī)則卷曲。從預測的CPA及CPA-His68Gly突變體分子的2級結構來看，二者除第68突變位點由無規(guī)則卷曲變成β轉角和第69位由無規(guī)則卷曲變成β折疊外，其余的2級結構沒有發(fā)生變化，說明CPA和CPA-His68Gly突變體分子的2級結構基本一致。以蛋白質結構數據庫（PDB）中已解析的CPA三維結晶結構（3D）為模板，在線（http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html）利用同源模型構建CPA和CPA-His68Gly突變體分子的3D結構，應用Rasmol分析軟件繪制其3D結構圖，結果顯示CPA共有10段α螺旋，8段β折疊，而CPA-His68Gly突變體的3級結構與CPA的3級結構相似。同時，將重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）的培養(yǎng)上清、菌體及菌體裂解物涂布于卵黃瓊脂平板上，均不出現特征性渾濁環(huán)，表明它們不能分解卵黃瓊脂平板中的卵磷脂，這說明重組菌株已不具備CPA的磷脂酶C活性，而A型產氣莢膜梭菌標準株C57-1培養(yǎng)上清在卵黃瓊脂平板上出現了特征性渾濁環(huán)。同時經腹腔注射或口服途徑接種重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），結果3周后小鼠全部存活，無異常表現，經剖檢觀察無病理變化，表明該菌株喪失了CPA活性，已無致病性，而A型產氣莢膜梭菌標準株C57-1對照組則出現典型的臨床癥狀和病理變化。免疫實驗結果表明，重組大腸桿菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）滅活菌體免疫組保護率為94%（75/80），A型產氣莢膜梭菌標準株C57-1類毒素免疫組保護率為95%（76/80），而生理鹽水對照組20只小鼠全部死亡，這說明構建的A型產氣莢膜梭菌CPA-His68Gly突變體蛋白和A型產氣莢膜梭菌標準株C57-1類毒素的免疫保護效果基本相同。

5 N端和C端的結構與功能

Titball等[23]對α毒素是否由2個區(qū)域組成進行了研究，他們構建了一個截短的α毒素CPA1-249，其表達產物保留了磷脂酶C活性，能水解磷脂酰膽堿，但卻失去了α毒素的鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性，這表明α毒素N端可能具有溶血活性和致死性。隨后，Titball等[5]又構建了α毒素C端CPA247-370，結果它不具有鞘磷脂酶活性、溶血性和致死性。然而，當用CPA1-249和CPA247-370共同作用于小鼠紅細胞時，卻能使小鼠紅細胞發(fā)生溶血，這表明C端能將溶血活性賦予N端，但也不能否認，CPA247-370結合CPA1-249后相互作用時，CPA 247-370構象發(fā)生變化，從而激活CPA247-370的活性位點，使其具有了酶活性。同時還證實α毒素的C端和真核細胞的一種脂質代謝酶——花生四烯酸脂肪氧化酶N端之間有同源性，均含有5個連在一起的酪氨酸殘基，疏水性酪氨酸殘基與糖類底物識別一致。通過化學修飾研究，還證實α毒素中組氨酸殘基和鋅離子的協同作用是很重要的，鋅離子結合在組氨酸殘基上[24]。

Nagahama等[25]構建了α毒素N端CPA1-250和C端CPA251-370，并研究了它們在α毒素生物學活性中的作用。產氣莢膜梭菌α毒素N端CPA1-250和蠟樣芽胞桿菌磷脂酶C（BcPLC）一樣都具有磷脂酶C活性，但前者不能結合兔紅細胞，也不能裂解兔紅細胞。由BcPLC和C端CPA251-370構建的雜合蛋白BC-CPA251-370能結合在紅細胞上且能裂解紅細胞。N端CPA1-250和C端CPA251-370在一起孵育后能夠實現完全互補且具有溶血活性和磷脂酶C活性，C端CPA251-370也能賦予BcPLC溶血活性。C端CPA251-370能夠顯著激活N端CPA1-250的磷脂酶C活性。進一步研究表明，C端CPA251-370對N端CPA1-250的相互作用顯示，可以誘導N端CPA1-250的結構改變，但是不能賦予N端CPA1-250溶血活性。動力學分析表明，C端CPA251-370能提高對底物N端CPA1-250的的親和力。作者使用熒光標記C端CPA251-370實驗首次證實，C端CPA251-370可以插入細胞膜脂質雙層，能夠引起N端CPA1-250接近磷脂酰膽堿，導致N端CPA1-250水解膜內的磷脂酰膽堿和破壞細胞膜。上述實驗結果表明，C端CPA251-370在結合紅細胞以及N端CPA1-250的溶血活性和酶活性方面發(fā)揮非常重要的作用。

Williamson等[26]克隆表達了CPA1-249和CPA 247-370，這2種產物的生物學效應有所不同。CPA1-249免疫動物后產生的抗體能中和α毒素的磷脂酶C活性，但不能中和α毒素的溶血活性。CPA247-370免疫動物后產生的抗體既能中和α毒素的磷脂酶C活性，也能中和α毒素的溶血活性，而且CPA247-370免疫鼠可抵抗至少10 LD100劑量的A型產氣莢膜梭菌攻毒。這些試驗結果充分說明，α毒素確實由2個區(qū)域組成，N端具有磷酯酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有兩者協同作用，才具有溶血活性和致死活性。單獨α毒素N端CPA1-249和C端CPA247-370的毒性很低，但其免疫動物后產生的抗血清中和效果不同，這是由于CPA247-370在單獨表達后，形成的高級結構與α毒素完整結構相似，故能中和α毒素的溶血活性和致死活性，表明α毒素的保護性抗原為其C端。如果是后者，C端在調控酶活性方面將起著重要作用[27-28]。總之，α毒素可能由2個功能區(qū)組成，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，然而僅依靠磷脂酶C活性不足以使α毒素具有毒性。α毒素C端表現溶血特性，如果去除α毒素的C端，就會大大降低鞘磷脂酶活性，但檢測不到α毒素的溶血性和致死性，可能是這些區(qū)域使蛋白質發(fā)生了構型改變，易于和細胞膜發(fā)生反應的緣故。

綜上所述，近年來關于產氣莢膜梭菌α毒素的研究報道，主要側重于α毒素基因的定點基因突變、α毒素N端和C端生物學功能，以及α毒素與靶細胞作用方式等方面，而關于產氣莢膜梭菌α毒素的基因轉錄調控、致病機制，以及α毒素在5種毒素型（A、B、C、D、E）產氣莢膜梭菌中的致病作用還需要進行深入細致研究，這對于闡明產氣莢膜梭菌α毒素的基因轉錄調控機制和致病機制具有重要的理論意義和實踐價值。

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