發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽消長規(guī)律及調控技術的研究進展

黃麗慧，張 雁*，陳于隴，魏振承

(1.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所，廣東省農產品加工公共實驗室，廣東 廣州 510610；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

發(fā)酵蔬菜是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工制品，風味清新獨特，千百年來在我國人們的餐桌上占有不可替代的一席之地。蔬菜發(fā)酵加工是利用有益微生物的活動并控制其生長條件對蔬菜進行的冷加工方式之一。采用不同的加工工藝，可得到泡菜、酸菜、醬菜和腌菜等多種形式的發(fā)酵蔬菜產品。蔬菜經過發(fā)酵加工，不僅形成了乳酸、雙乙酰、酮類化合物等風味物質，而且產生了大量以乳桿菌、雙歧桿菌等乳酸菌為主的益生菌，賦予了發(fā)酵蔬菜產品獨特的風味及優(yōu)良的保健功能。

蔬菜是容易累積硝酸鹽的作物，在世界各地區(qū)人民膳食中硝酸鹽日攝入量貢獻率達30%～90%不等[1]。現(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵體系中，蔬菜中的硝酸鹽會被大量還原，產生發(fā)酵蔬菜的亞硝酸鹽積累問題。亞硝酸鹽會對人體產生多種危害，主要包括引發(fā)高鐵血紅蛋白癥和形成致癌物質亞硝胺。研究[2]表明，胃癌、食道癌等消化系統(tǒng)癌癥高發(fā)地區(qū)往往與其膳食中過量的硝酸鹽和亞硝酸鹽有關。

目前，發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的形成機理已基本明確，大量研究仍然集中在蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽變化規(guī)律的探討方面，通過發(fā)酵菌種篩選、發(fā)酵工藝條件調控等技術手段降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量依然是當前研究的熱點。本文概述發(fā)酵蔬菜加工貯藏過程中亞硝酸鹽動態(tài)變化規(guī)律及調控技術的研究進展，以期為工業(yè)化生產安全和營養(yǎng)的發(fā)酵蔬菜提供參考。

1 蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的形成機制與動態(tài)變化規(guī)律

1.1 蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的形成機制

在發(fā)酵體系中，蔬菜中累積的硝酸鹽會在硝酸還原酶的作用下被大量轉化為亞硝酸鹽。硝酸還原酶主要由蔬菜表面和腌制器具所攜帶的微生物分泌，也存在于發(fā)酵原料蔬菜中。硝酸還原反應大部分在乳酸菌等發(fā)酵微生物生長的優(yōu)勢環(huán)境即鹵水中進行，但菜體中也會部分發(fā)生[3]。國內外均有研究[4-5]證明，腸桿細菌和黃桿菌屬等革蘭氏陰性菌分泌的硝酸還原酶的作用是發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽大量形成的原因。發(fā)酵體系中產生的亞硝酸鹽可在亞硝酸鹽還原酶的作用下或與酸作用而被分解。

1.2 蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的變化規(guī)律與機理

大量研究證實，蔬菜腌漬過程中亞硝酸鹽含量均呈先增加后減少的變化趨勢，且都會出現(xiàn)NO2—高峰即亞硝峰現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，pH值為4左右時亞硝酸鹽含量達到最大值，此后亞硝酸鹽含量下降[4,6]。

1.2.1 亞硝峰的形成

大腸桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和黏質賽氏桿菌等腌制過程容易污染的微生物具有很強的硝酸還原能力[7]。在腌制的初期，乳酸菌處于繁殖階段，酸性環(huán)境尚未形成，來自蔬菜和腌制器具的上述有害菌會迅速繁殖，引起亞硝酸鹽含量上升。

Mundt等[8]認為新鮮蔬菜中革蘭氏陰性好氧菌和酵母菌占優(yōu)勢，乳酸菌數(shù)量較少。Fleming等[9]研究發(fā)現(xiàn)在產氣發(fā)酵階段初期(1～3d)乳酸菌和總菌數(shù)迅速上升。對甘藍鹵中微生物區(qū)系分析表明，發(fā)酵初期有很多細菌及一定數(shù)量的霉菌和酵母菌，發(fā)酵1d后霉菌及酵母菌消失，隨著發(fā)酵的進行，雜菌種類及數(shù)量減少，乳酸菌數(shù)量及占細菌總數(shù)的比例增加[4]。

1.2.2 亞硝峰的消失

隨著發(fā)酵的進行，水中溶氧量減少，需氧的硝酸還原菌生長受到抑制，但不影響厭氧的乳酸菌代謝產酸。因而形成的酸性環(huán)境會逐漸抑制有害菌生長。pH＜4.5時，腸桿菌科、酵母菌等多種雜菌的生長都會被抑制[10]。何淑玲[11]研究證明pH5.0是硝酸還原酶酶活起動點，pH4.5及以下能抑制硝酸還原酶活性，減少硝酸還原作用。

另外，亞硝酸鹽可與乳酸作用生成亞硝酸而分解，溫度越高，酸度越大，亞硝酸分解越快。最后，發(fā)酵體系中產生的亞硝酸鹽除了與酸反應被分解之外，酶作用也使亞硝酸鹽減少。一些乳酸菌和大腸桿菌能產生亞硝酸鹽還原酶，降低亞硝酸含量[12-13]。張慶芳[6]、紀淑娟[14]等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解兩個階段。發(fā)酵初期，當培養(yǎng)液pH＞4.5時，乳酸菌產生亞硝酸鹽還原酶分解亞硝酸鹽起主導作用，發(fā)酵后期，當pH＜4時，亞硝酸鹽的降解以酸降解為主。有待進一步研究。

1.2.3 發(fā)酵蔬菜與鹵水中硝酸還原酶酶活力與亞硝酸鹽含量變化的關系

為深入研究蔬菜中和微生物產生的硝酸還原酶對亞硝酸鹽變化的影響，很多研究者對發(fā)酵過程中酶活的變化規(guī)律進行了研究。郭曉紅[4]、紀淑娟[14]、Wang Changlu[15]等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中蔬菜中的硝酸鹽還原酶活性只在發(fā)酵初期出現(xiàn)，然后一直下降。

何淑玲等[16]研究則表明泡菜亞硝峰出現(xiàn)時間與泡菜組織中及鹵水細菌中硝酸還原酶最大的出現(xiàn)時間均一致。何玲等[17]研究證明漿水芹菜發(fā)酵時芹菜中酶活變化也呈先增后減趨勢，且酶活最大值出現(xiàn)時間與亞硝峰相一致。但漿水芹菜發(fā)酵前必須熱燙，而熱燙會降低蔬菜中的酶活性并減少菜體上乳酸菌的數(shù)量，因而對發(fā)酵過程中酶活變化有一定影響。高祖明等[18]研究發(fā)現(xiàn)腌白菜與腌雪里紅中的硝酸還原酶活性和亞硝酸鹽含量的變化趨勢呈正相關。

綜上所述，發(fā)酵鹵水中硝酸還原酶的酶活變化規(guī)律與亞硝酸鹽變化規(guī)律一致，但菜體中酶活與亞硝峰是否有關聯(lián)并無定論，前人均未對2種硝酸還原酶酶酶活變化差異性的原因做深入探討，因此還有待進一步研究。

1.2.4 影響蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化的因素

蔬菜品種、食鹽質量分數(shù)、發(fā)酵溫度等工藝參數(shù)、工藝條件不同都會對亞硝酸鹽的變化產生影響。楊性民等[19]研究了鹽度、發(fā)酵方式和品種等因素對雪菜亞硝酸鹽含量的影響，并首次建立了2個數(shù)學模型，可作為對各階段亞硝酸鹽含量作出預測的有效方法。這些因素會對亞硝峰的出現(xiàn)時間、峰值及高峰持續(xù)時間產生影響，但不改變亞硝酸鹽的整體變化趨勢。

2 降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量技術的研究與應用進展

2.1 發(fā)酵工藝條件對產品中亞硝酸鹽含量的調控

2.1.1 發(fā)酵浸漬液酸度的優(yōu)化

腌漬液酸度越高，亞硝峰出現(xiàn)越早且峰值越低，終產品的亞硝酸鹽含量也越低。因此發(fā)酵過程中提高酸度可以降低NO2—的含量。

McDonald等[20]研究證明添加乙酸(0.667mol/L)或乙酸鈣緩沖液(0.113mol/L)到鹵水中能抑制自然發(fā)酵初期大腸桿菌的生長，但不影響乳酸菌生長。何淑玲[11]研究低pH值對亞硝酸鹽降解作用的機理，發(fā)現(xiàn)低pH值(4.5及以下)一方面抑制了硝酸還原酶的活性，另一方面加速了亞硝酸鹽的降解。在實際腌制過程中，控制腌制液的pH值在4.5以下，有害微生物的生長繁殖就受到抑制。

2.1.2 發(fā)酵溫度的選擇

高溫發(fā)酵，亞硝酸鹽生成快，亞硝峰出現(xiàn)早，峰值低且消失快。這是由于高溫不僅有利于乳酸菌代謝產酸[21]，也加速了亞硝酸鹽從蔬菜中滲出到腌漬液中。一般認為乳酸菌發(fā)酵的最適溫度為25～30℃，發(fā)酵初期溫度過高或食鹽質量分數(shù)過低，丁酸細菌發(fā)酵會產生沼氣造成大量氨的積存，后期如遇適當條件會形成亞硝酸[22]。因此發(fā)酵初期溫度不宜過高，以免引起丁酸發(fā)酵，發(fā)酵產生一定乳酸后，可適當提高溫度。

2.1.3 發(fā)酵液鹽度的控制

食鹽質量分數(shù)低，抑菌作用小，亞硝酸鹽的生成快，到達亞硝峰的時間短。食鹽促進了蔬菜中的亞硝酸鹽滲出，并加快蔬菜汁液滲透到鹵水中，供給乳酸發(fā)酵所需營養(yǎng)；但高鹽會抑制乳酸菌代謝和分泌的亞硝酸還原酶的活性[21]。因此食鹽用量應在既不影響乳酸發(fā)酵，又能抑制微生物生長的范圍內。

Pederson等[23]研究發(fā)現(xiàn)食鹽質量分數(shù)7.5%以上時對乳酸發(fā)酵產酸有很強烈的抑制作用。?zcan[24]認為室溫條件下，5%～10%的食鹽是乳酸菌發(fā)酵刺山柑的適宜質量分數(shù)，食鹽質量分數(shù)低于5%時對有害菌(細菌、霉菌、大腸菌)生長的抑制作用會減弱。

2.1.4 發(fā)酵厭氧條件的保持

硝酸還原菌是需氧菌，而乳酸菌是厭氧菌，因此要注意保持發(fā)酵中的厭氧環(huán)境。將菜體排緊壓實，發(fā)酵鹵液要淹沒菜體，并將發(fā)酵壇口水封。

2.1.5 發(fā)酵過程中亞硝酸鹽清除劑的添加

2.1.5.1 抗氧化劑去除亞硝酸鹽的研究

多種還原性物質對于醬腌菜中NO2—的清除作用已見報道[25]，其中研究得最多的是VC和茶多酚。Mirvish等[26]認為VC與亞硝酸鹽的物質的量比為2：1時，阻斷率為100%。汪勤等[27]研究發(fā)現(xiàn)VC與亞硝酸鹽濃度比為100：1時可達到完全消除亞硝酸鹽的目的。研究[28]發(fā)現(xiàn)，茶多酚(tea polyphenols，TP)是通過抑制與NO2—形成有關的細菌的活動以及與NO3—、NO2—作用而降低醬菜中的NO2—含量，且以TP與NO2—的直接作用為其主要降低途徑。

黃葦?shù)萚29]研究抗壞血酸、檸檬酸和茶多酚對于腌菜中亞硝根的清除作用時，發(fā)現(xiàn)它們復配使用具有顯著的協(xié)同增效作用，并提出可在發(fā)酵前期加入酸性較強的抗氧化劑，抑制雜菌生長；后期再加入還原性較強的添加劑清除亞硝酸根離子。

2.1.5.2 發(fā)酵輔料對亞硝酸鹽的清除作用

蒜、蔥、姜、辣椒等香辛料常被添加于泡菜制作中，來改善產品的風味。亞硝酸鹽具有氧化性，可被還原，香辛料都含有一些天然抗氧化成分，因此都具有一定的消除亞硝酸鹽的能力，消除量取決于還原性成分的種類、含量及其氧化還原特性[25]；這些發(fā)酵輔料能抑制腸桿菌科細菌、真菌等有害雜菌的生長，因此能降低亞硝酸鹽的生成；香辛料中含有的巰基化合物，可與亞硝酸鹽生成硫代亞硝酸鹽酯類化合物，減少了亞硝酸鹽的積累[30]。

張瑞宇等[31]研究發(fā)現(xiàn)在高溫預熱和pH值為2的條件下，常用于腌制醬菜的苦藠的粗提液對蔬菜中的亞硝酸鹽清除效率達到82.7%，而高溫條件下苦藠中的少量VC會被破壞，因此認為其清除亞硝酸鹽的機理是由于苦藠中存在著耐高溫的其他活性成分。

2.1.6 滅菌工藝的影響

加熱殺菌是國內泡菜生產的主要滅菌方式，但陳義倫等[32]研究表明加熱殺菌對抑制發(fā)酵甘藍中亞硝酸鹽積累的效果不明顯，認為是由于熱力殺菌不僅抑制了雜菌的活動，也抑制了乳酸菌代謝產酸。李書華[33]將加熱殺菌后的泡姜在常溫條件下貯藏，亞硝酸鹽含量下降，分析認為加熱殺死了硝酸鹽還原細菌、硝酸鹽還原酶及亞硝酸鹽還原酶的活性，其亞硝酸鹽的降低可能是由于發(fā)生了非酶促反應。

2.2 貯藏條件對產品中亞硝酸鹽含量的調控

在貯藏過程中，發(fā)酵蔬菜產品中亞硝酸鹽含量通常呈下降趨勢。同時，處理方法對亞硝酸鹽含量變化的影響較大，主要包括貯藏溫度、包裝及貯藏方式、添加發(fā)酵液貯藏等幾個方面。

2.2.1 貯藏溫度的影響

低溫貯藏能抑制雜菌的活動和酶的活性，減少亞硝酸鹽含量。室溫保存條件下，腌菜中微生物活動頻繁，亞硝酸鹽含量會上升，此時腌菜不能長期放置，應及時加工[32,34]。

2.2.2 包裝及貯藏方式的影響

真空包裝有利于降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量。郭曉紅等[35]認為發(fā)酵萵筍真空包裝后亞硝酸鹽含量降低是由于產品中仍有少量乳酸菌代謝產酸，且在室溫條件下，由于酸度增加，亞硝酸鹽含量比冰箱存放減少更多。這與劉冬梅等[36]的研究結果一致。這可能與研究中的發(fā)酵前熱燙及添加蒜汁、接種發(fā)酵等方法增加了貯藏前泡菜產品中的乳酸菌的數(shù)量有關。陳義倫[32]、李書華[33]等研究認為低溫結合真空包裝貯藏能最大程度地降低泡菜中的亞硝酸鹽含量。

2.2.3 添加發(fā)酵液貯藏

發(fā)酵蔬菜產品包裝過程中還可添加一定食鹽質量分數(shù)的發(fā)酵液來抑制微生物的活動，?zcan[24]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵刺山柑在質量分數(shù)為15%的新鮮食鹽水中保藏能有效抑制雜菌并保持良好色澤。

2.3 生物學方法在降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量中的應用

生物學應用于發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的調控主要包括改變發(fā)酵方式、篩選菌種進行接種發(fā)酵及酶法處理等三方面。

2.3.1 發(fā)酵方式的優(yōu)化

人工接種乳酸菌發(fā)酵或用陳鹵發(fā)酵相比于自然發(fā)酵可降低亞硝酸鹽含量，阻止“亞硝峰”的出現(xiàn)。產生該現(xiàn)象的原因是由于乳酸菌種群在發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢被加強，加快乳酸菌繁殖，抑制了有害菌的生長；亞硝酸還原酶活性升高[14]，促進了亞硝酸鹽的酶降解。另外，Adams等[37]認為乳酸菌代謝產生的有機酸、細菌素、雙乙酰、過氧化氫等物質也起到了抑菌作用。

2.3.2 降低產品中亞硝酸鹽含量菌株的篩選和應用

篩選合適菌種接種發(fā)酵蔬菜是當前國內外研究的熱點，多種乳桿菌[38-41]和腸膜明串珠菌[41]都具有還原亞硝酸鹽的性質。利用不同菌株優(yōu)劣互補，應用混合菌株進行發(fā)酵，對亞硝酸鹽的降低效果要優(yōu)于單一菌株[42-43]。

發(fā)酵菌種對亞硝酸鹽的消除作用與其產酸特性和產亞硝酸鹽還原酶性質相關。劉冬梅等[36]將LCR 719菌種接種于芥菜中發(fā)酵，根據(jù)對酸度的分析，認為產生L-乳酸引起酸度下降是亞硝酸鹽含量降低的原因。張慶芳等[44]研究證明亞硝酸鹽含量在250mg/L以內，接種短乳桿菌48h亞硝酸鹽就可全部去除。分析得出符合酶反應特性，認為亞硝酸鹽的降解主要是是由酶作用引起，且亞硝酸鹽對乳酸菌代謝有抑制作用[44-45]。兩人研究結果的不同與不同菌珠的產酸及產酶特性的差異相關。

Dodds等[46]就對TS4乳酸桿菌產亞硝酸鹽還原酶的特性進行了研究,發(fā)現(xiàn)該酶是在厭氧條件下由亞硝酸鹽誘導產生的，酶活的發(fā)揮需要電子傳遞體的參與，葡萄糖和NADH分別是完整細胞和細胞胞漿中最佳的電子供體。Wolf等[47]認為具有亞硝酸還原作用的菌種還只發(fā)現(xiàn)于乳酸菌和片球菌中，提出亞硝酸鹽還原作用根據(jù)機理可分為兩種，Ⅰ型血紅素依賴型還原產物是氨，Ⅱ型血紅素非依賴型還原產物是NO和N2O，大部分亞硝酸還原菌是屬于Ⅱ型，Ⅰ型只發(fā)現(xiàn)于植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和戊糖片球菌中。

2.3.3 酶法處理的應用

亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase)能夠將NO2—還原，因此理論上可將該酶提純添加于發(fā)酵蔬菜中降低亞硝酸鹽含量。NiRs可作為一種胞內酶存在于高等植物、藻類植物和許多微生物中，但胞外效果差，將其提取并制為活性酶制劑還并未運用于實踐。

Jose等[48]從衣藻中將鐵氧還蛋白-亞硝酸還原酶固定化，但制取的亞硝酸鹽還原酶的酶活下降。鄭懷忠[49]、呂玉濤[50]通過對產亞硝酸鹽還原酶菌株進行紫外誘變、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方式來提高產酶特性，并將酶提純應用于亞硝酸鹽含量超標的食品中，取得了良好的亞硝酸鹽清除效果。這些研究工作對后續(xù)的研究具有一定的借鑒意義，但將微生物或酶固定化提純添加應用到食品中，還需要在酶活穩(wěn)定性、尋找亞硝酸鹽還原酶的有效載體、酶的安全性等方面作更加深入的研究。

3 結 語

作為中國傳統(tǒng)食品，發(fā)酵蔬菜發(fā)展前景廣闊。降低發(fā)酵蔬菜的亞硝酸鹽含量有利于提高產品安全性，現(xiàn)有的研究表明，可通過優(yōu)化發(fā)酵技術、添加亞硝酸鹽清除物等方式進行亞硝酸鹽含量調控。目前，國內醬腌菜產品多采用自然發(fā)酵生產，發(fā)酵菌種和接種發(fā)酵技術的研發(fā)比較落后。因此，加強優(yōu)良乳酸菌種的篩選和純種發(fā)酵技術的應用是降低產品亞硝酸鹽含量、提升發(fā)酵蔬菜品質的可行途徑。

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