非去極化心臟停搏液短時常溫保存對豬冠狀動脈內皮依賴性舒張功能的影響

陳蒙蒙，黑飛龍，吳 蓓，王世磊，秦春妮，楊勝男，王 晨，龍 村

非去極化心臟停搏液短時常溫保存對豬冠狀動脈內皮依賴性舒張功能的影響

陳蒙蒙，黑飛龍，吳 蓓，王世磊，秦春妮，楊勝男，王 晨，龍 村

目的探討短時常溫（1 h，37℃）條件下，非去極化心臟停搏液（NDP）對豬冠脈內皮源性超極化因子（EDHF）介導的血管舒張功能的影響。方法 根據保存液的不同，將血管環(huán)分成四組，分別為對照（CON）組、St.Thomas（ST）組、HTK組、NDP組。采用器官槽法，將血管環(huán)分別置于Krebs-Hensleit（KH）液、ST液、HTK液、NDP液中，37℃條件下保存1 h，加入一氧化氮合酶阻滯劑N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）和環(huán)加氧酶阻滯劑（Indomethacin），記錄由前列腺素F2α（U46619）及緩激肽（Bradykinin）引起的血管收縮和舒張反應。結果 NDP組中EDHF介導的內皮依賴性血管舒張百分比最大，為（74.79±6.40）％，其余依次為HTK組（51.32±21.92）％、CON組（24.03±8.01）％、ST組（16.20±6.39）％。結論 短時常溫（1 h，37℃）條件下，NDP液對冠脈內皮的舒張功能具有保護作用，且優(yōu)于HTK組、CON組和ST組。

血管環(huán)；保存液；內皮源性超極化因子

在冠脈循環(huán)系統(tǒng)中，內皮具有多種生理功能，尤其在調節(jié)血管張力方面發(fā)揮著關鍵的作用[1]。內皮主要通過釋放內皮源性舒張因子調節(jié)血管張力，包括一氧化氮（nitric oxide，NO），前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）和內皮源性超極化因子（endotheliumderived hyperpolarizing factor，EDHF）[2]。研究發(fā)現(xiàn)臨床廣泛應用的高鉀去極化停搏液嚴重損害血管內皮的舒張功能，主要影響EDHF介導的血管內皮依賴性舒張功能[3]。為了改善冠脈血管內皮的保護效果，課題組對原有停搏液進行改進，引入了“靜息停搏”和“血管保護”的理念，設計出一種新型的“非去極化心臟停搏液（non-depolarizing solution，NDP）”。本研究應用一氧化氮合酶阻斷劑L-NNA和環(huán)加氧酶阻斷劑Indomethacin分別阻斷NO和PGI2的作用，旨在探討短時常溫（1 h，37℃）保存條件下，NDP液對豬冠狀動脈內皮EDHF介導的舒張功能的保護效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 PowerLab八通道高速記錄主機（澳大利亞ADInstruments公司），橋式放大器（澳大利亞ADInstruments公司），離體組織灌流裝置（澳大利亞ADInstruments公司），高精度張力傳感器（澳大利亞ADInstruments公司），恒溫循環(huán)水?。ㄓ鳷ECHNE公司）。

1.1 實驗試劑 一氧化氮合酶阻斷劑N-硝基-L-精氨酸（L-NNA，美國sigma公司），環(huán)加氧酶阻斷劑吲哚美辛（Indomethacin，美國sigma公司），前列腺素F2α（U46619，美國Cayman公司），緩激肽（Bradykinin，美國sigma公司）。

1.3 溶液配制 Krebs-Hensleit（KH）液（mmol/L）：NaCl 118.5，KCl 4.75，MgSO41.19，KH2PO41.18，NaHCO325.0，CaCl21.4，葡萄糖11.0，pH 7.4。St.Thomas（ST）液（mmol/L）：NaCl 110，KCl 16，CaCl 1.2，NaHCO325，pH 7.8。Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 9，MgCl2· 6H2O 4，甘露醇30，L-組氨酸180，組氨酸鹽酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸鉀鹽1，pH 7.3。NDP液（mmol/L）：NaCl 15，KCl 5，MgCl2·6H2O 4，L-組氨酸180，組氨酸鹽酸18，色氨酸2，α-酮戊二酸1，棉子糖30，谷光甘肽3，腺甘0.2，利多卡因0.5，尼可地爾0.01，pH 7.4。

1.4 實驗對象 豬心，600～800 g。

1.5 實驗分組及模型建立 根據保存液的不同實驗分為四組，分別為對照（CON）組、ST組、HTK組、NDP組。于附近的屠宰場獲取新鮮豬心，置于4℃冷KH液中迅速帶回實驗室。分離冠脈的左前降支，取中下1/3段截取成若干段2.2～2.8 mm，長度5 mm左右的血管環(huán)。保證每次實驗中，四種不同保存液組的血管環(huán)來自同一豬心冠脈左前降支，每組樣本量（n＝8）相同。將血管環(huán)懸掛在一對三角形不銹鋼絲上，置于盛有37℃、經95％O2+5％CO2混合氣體飽和的KH液的玻璃浴槽中固定。緩慢調節(jié)血管環(huán)的靜息張力，使其在2.5 g左右達到平衡。平衡1 h后，將血管環(huán)分別浸泡于37℃的KH液、ST液、HTK液、NDP液，保存1 h。保存時間到后，用37℃KH液更換不同保存液，平衡30 min，加入7 μmol/L Indomethacin和300 μmol/L L-NNA，水浴30 min后，加入30 nmol/L U46619收縮血管，20 min左右達到平臺，依次加入終濃度為10-10mol/L、10-9.5mol/L、10-9mol/L、10-8.5mol/L、10-8mol/L、10-7.5mol/L、10-7mol/L、10-6.5mol/L、10-6mol/L的Bradykinin舒張血管，每個濃度點之間的時間間隔為2 min，在每個濃度點測定血管張力。

1.6 觀察指標 37℃條件下平衡1 h后，各組血管環(huán)靜息張力（g）；各組保存1 h后的血管張力及變化幅度（g）；加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后血管張力的改變（g）；各組加入U46619后血管的收縮幅度；不同濃度Bradykinin引起的EDHF介導的內皮依賴性舒張百分比（占U46619收縮幅度的百分比）。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 18.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，數據采用均數±標準差（）表示。采用隨機區(qū)組設計方差分析對數據進行統(tǒng)計分析，各組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。所有計量數據檢驗前均經方差齊性和正態(tài)分布檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同的停跳液保存1 h后血管靜息張力的改變 平衡期各組血管環(huán)靜息張力無顯著差異。37℃保存1 h后，CON組、HTK組靜息張力幾乎沒有改變，ST組靜息張力有所增加，NDP組靜息張力顯著下降，見圖1。

圖1 各組保存1 h后靜息張力改變

2.2 加入阻斷劑后血管張力的改變 各組加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后血管靜息張力均有所增加，與ST組、HTK組相比，NDP組張力變化幅度明顯減小，見圖2。

圖2 各組加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA 30 min后靜息張力改變

2.3 加入U46619收縮血管，記錄最大血管收縮張力 不同的停搏液組中加入收縮劑U46619后，血管環(huán)的張力均明顯增加，但各組比較無顯著統(tǒng)計學差異，見圖3。

圖3 各組加入血管收縮劑U46619后血管張力的改變

2.4 Bradykinin介導的內皮依賴性血管舒張作用

在各組不同的停搏液中，依次加入10-10～10-6mol/L濃度的Bradykinin，隨Bradykinin濃度的增大，血管舒張幅度也逐漸增大，其中NDP組中Bradykinin引起的EDHF介導的內皮依賴性血管舒張百分比最大，其次分別為HTK組、CON組、ST組，見圖4。

圖4 不同濃度Bradykinin引起的EDHF介導的內皮依賴性血管舒張百分比

3 討 論

近年來很多研究提示傳統(tǒng)的高鉀停搏液會損害冠脈血管內皮的功能[3-5]，而內皮的完整性對維持正常的心功能至關重要[6-7]，因此，研究不同心臟停搏液對血管內皮的保護作用非常重要。內皮主要釋放三種內皮源性舒張因子，包括NO，PGI2和EDHF，EDHF在冠脈血管張力的調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，尤其是當NO和PGI2的作用受損時，EDHF的作用會代償性增強，從而維持血管張力的穩(wěn)定。本研究應用阻斷劑Indomethacin和L-NNA分別阻斷PGI2和NO的作用，主要探討新型非去極化心臟停搏液，即NDP液對EDHF介導的血管內皮依賴性舒張作用的影響。

不同的心臟保存液成分對血管的靜息張力會產生不同的影響。本研究中，血管環(huán)在常溫保存1 h后，CON組和HTK組血管張力變化不大，而ST組血管環(huán)的靜息張力明顯增高，升高幅度為（0.1276± 0.0412）g，NDP組的血管靜息張力明顯下降，下降幅度為（0.3445±0.0884）g。加入阻斷劑Indomethacin和L-NNA后，發(fā)現(xiàn)各組血管環(huán)靜息張力均有所增加，其中ST組血管張力增加的幅度最大，為（0.2734±0.0914）g，而NDP組血管張力增加的幅度最小，為（0.0987±0.1146）g。以上結果均提示ST液會引起冠脈血管的收縮，與Dong等的研究結果結果相一致[8]，而NDP液能夠較好地維持血管張力的穩(wěn)定。

不同作用原理的保存液對血管的收縮和舒張功能的影響也不相同。先使用U46619對血管環(huán)進行收縮，各組血管環(huán)收縮幅度無顯著性差異。隨后，依次加入不同濃度（10-10～10-6mol/L）Bradykinin。隨著Bradykinin濃度的增加，EDHF介導的血管內皮依賴性舒張百分比逐漸增大，其中NDP組和HTK組血管舒張百分比明顯升高，而ST組、CON組隨Bradykinin濃度的升高，血管的內皮依賴性舒張反應性相對下降，且ST組低于CON組，提示短時常溫（1 h，37℃）保存時，NDP液和HTK液能夠較好地保護血管的舒張功能，而ST液對EDHF介導的血管內皮依賴性舒張功能具有損害作用，其中主要是高濃度鉀離子的作用[8]。

本研究的結果顯示，不同停搏液對血管靜息張力以及EDHF介導的血管內皮依賴性舒張功能的影響不同，這可能與各種停搏液的成分不同有關。與CON組、HTK組、NDP組相比，ST組中血管靜息張力明顯增加，EDHF介導的血管內皮依賴性舒張作用明顯受損。多項研究證實傳統(tǒng)高鉀停搏液損害血管內皮功能，尤其是損害EDHF介導的內皮依賴性舒張作用，原因主要體現(xiàn)在如下兩方面[3-5]：首先，EDHF通過使細胞膜電位超極化發(fā)揮作用，而高濃度K+使平滑肌細胞膜電位去極化，抑制了EDHF介導的舒張作用；其次，EDHF通過開放K+通道使平滑肌細胞膜電位超極化，尤其是Ca2+離子激活的K+通道和ATP敏感性K+通道，而高濃度K+會對這些K+通道產生抑制作用。

與CON組、ST組相比，HTK組對血管靜息張力的影響較小，也能較好地保護EDHF介導的內皮依賴性血管舒張作用。Pizzicannella等[9]應用免疫組織化學方法和超微結構分析證明，與生理鹽水相比，HTK液對內皮細胞具有更好的保護效果。HTK液對血管內皮功能有較好的保護效果，可能與其成分特點相關[10-11]：K+濃度為9 mmol/L，稍高于K+的生理濃度，對血管內皮的影響較?。患毎獾外c可以減輕內皮細胞水腫，微鈣有利于保護血管的舒張功能；組氨酸/組氨酸鹽緩沖系統(tǒng)能夠減輕缺血期間的細胞酸中毒。

NDP液為非去極化型心臟停搏液，K+濃度為5 mmol/L，低于ST液和HTK液，處于K+的生理濃度范圍之內。與其它三組相比，NDP組能夠輕微降低血管靜息張力，不引起血管的收縮反應，并且其保護EDHF介導的內皮依賴性血管舒張功能的效果最優(yōu)。分析NDP液組成，其血管保護作用優(yōu)于其它三組的主要原因是：腺苷、利多卡因和尼可地爾可將細胞膜電位鉗制在靜息電位水平，抑制了電壓依賴性Ca2+通道的開放，減少了鈣內流和細胞內儲存鈣釋放，從而能夠有效維持血管的靜息張力，保護血管內皮舒張功能。其中，腺苷通過與腺苷受體結合激活ATP敏感性K+通道發(fā)揮心血管保護作用[12]，Jakobsen等[13]應用腺苷取代停搏液中高濃度K+，發(fā)現(xiàn)腺苷能夠保護EDHF介導的內皮依賴性舒張作用；Dong等[14]研究證明尼可地爾能夠改善停搏液對血管內皮的保護效果，保護EDHF介導的內皮依賴性舒張作用，可能機制為其開放ATP敏感性K+通道，使平滑肌細胞膜電位超極化，與EDHF的作用協(xié)同，從而保護了EDHF介導的內皮依賴性舒張作用。

實驗結果表明，短時常溫（1 h，37℃）保存后，NDP液具有良好的血管內皮保護效果，其作用明顯優(yōu)于CON組、ST組和HTK組。NDP液可使平滑肌細胞膜電位超極化，促進EDHF的釋放，保護了EDHF介導的血管內皮依賴性舒張功能。此外，組氨酸緩沖系統(tǒng)、抗氧化劑谷胱甘肽、非滲透物質棉子糖的加入，進一步增強了血管保護效果。NDP液血管保護的特點彌補了傳統(tǒng)高鉀停搏液損害血管內皮功能的不足，更符合理想心臟停搏液的特點，既滿足了心臟外科手術的要求，又極大程度地改善了心臟的保護效果。但目前NDP液的研究還處于基礎研究階段，還需要進一步的臨床研究證實，從而為NDP液的臨床應用奠定堅實的基礎。

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The protective effect of non-depolarizing solution on the endothelium-related relaxation of porcine coronary arteries under normal temperature

Chen Meng-meng，Hei Fei-long，Wu Bei，Wang Shi-lei，Qin Chun-ni，Yang Sheng-nan，Wang Chen，Long Cun
Department of CPB，State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Disease，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，People＇s Republic of China

Hei Fei-long，Email：heifeilong＠126.com

ObjectiveThe present study was designed to evaluate the protective effect of non-depolarizing solution（NDP）on the endothelium-derived hyperpolarizing factor（EDHF）-mediated relaxation of porcine coronary arteries after rings were incubated with NDP solution at 37℃for 1 hour.MethodsDue to different preservation solutions used in different groups，the rings were divided into four groups：control（CON）group，St.Thomas（ST）group，Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate（HTK）group and NDP group.Rings from porcine coronary arteries were studied in the organ chamber.After equilibration，the rings were incubated with Krebs-Helenseit solution in CON group，St.Thomas solution in ST group，HTK solution in HTK group，non-depolarizing solution in NDP group at 37℃for 1 hour.Then Pre-contraction tone induced by prostaglandin F2α（U46619）and endothelium-dependent relaxation tone induced by bradykinin was measured in the presence of indomethacin and L-NNA.ResultsAfter incubation with different solutions at 37℃for 1 hour，the EDHF-mediated relaxation induced by bradykinin was much higher in the NDP group 74.79％±6.40％ than in the HTK group 51.32％±21.92％，CON group 24.03％±8.01％and ST group 16.20％±6.39％.ConclusionNDP solution provides superior endothelium protective effect compared with ST and HTK solution under normal temperature.

Vascular rings；Preservation solutions；Endothelium-derived hyperpolarizing factor

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0252-05

2013-08-01）

2013-08-29）

國家自然科學基金資助項目（30972866）

北京市自然科學基金資助項目（7102131）

100037北京，北京協(xié)和醫(yī)學院，中國醫(yī)學科學院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院，心血管疾病國家重點實驗室，體外循環(huán)科

黑飛龍，Email：heifeilong＠126.com