烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用

魏毅君，段維勛，熊紅燕，雷蘭萍，楊陽，陳濤，金振曉

烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用

魏毅君，段維勛，熊紅燕，雷蘭萍，楊陽，陳濤，金振曉

目的研究烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）孵育后活化，正常人血液分離的中性粒細(xì)胞經(jīng)TNF-α孵育后激活，活化的HUVECs與激活的中性粒細(xì)胞共孵育建立中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷體外模型。共孵育體系中加入不同濃度的烏司他?。?00、500、1 500、3 000和5 000 U/ml），MTT法檢測內(nèi)皮細(xì)胞存活率，同時檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性（LDH）、一氧化氮（NO）含量和彈性蛋白酶活性。中性粒細(xì)胞與TNF-α及不同濃度的烏司他丁共孵育后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶活性。結(jié)果 激活的中性粒細(xì)胞與活化的HUVECs共孵育可以顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞存活率，同時培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高、NO含量顯著降低、彈性蛋白酶活性顯著升高，烏司他丁可以劑量依賴性對抗上述變化。同時，烏司他丁可以劑量依賴性降低TNF-α激活的中性粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶的活性。結(jié)論 烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用具有劑量依賴性，其機制與烏司他丁抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)及釋放到細(xì)胞外的彈性蛋白酶的活性有關(guān)。

烏司他??；內(nèi)皮細(xì)胞；中性粒細(xì)胞；彈性蛋白酶

人類中性粒細(xì)胞內(nèi)含有許多蛋白酶，這些蛋白酶產(chǎn)生的蛋白溶解作用是中性粒細(xì)胞吞噬和消滅病原微生物的主要機制，因此，在抗感染機制中具有重要作用。但是，如果這些蛋白酶從中性粒細(xì)胞中不受限制地釋放出來，也會對細(xì)胞外基質(zhì)和其它自身細(xì)胞造成損傷[1]。絲氨酸蛋白酶是哺乳動物體內(nèi)種類最多的一類蛋白酶，其中彈性蛋白酶以激活形式儲存在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中，在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮著尤其重要的作用。彈性蛋白酶在中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中也具有重要作用，是炎癥反應(yīng)引起血管損傷的重要基礎(chǔ)[2]。近年來，多種彈性蛋白酶抑制劑在實驗室中分離出來[3-5]，有的已經(jīng)用于臨床抗炎癥反應(yīng)性疾病的治療，有的還處于實驗室研究階段。目前，臨床上最常用的蛋白酶抑制劑是烏司他丁，烏司他丁是一種從正常男性尿液中提取的蛋白酶抑制劑，常用于對抗過度炎癥反應(yīng)引起的各種組織損傷，可以有效抑制中性粒細(xì)胞分泌的彈性蛋白酶和胰蛋白酶的活性[6]。本研究的主要目的是觀察烏司他丁是否能在體外抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并初步探討其對內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用與其對彈性蛋白酶活性的抑制作用之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)胞與儀器 重組人腫瘤壞死因子α（rhTNF-α）（R＆D公司，美國），干擾素γ（IFN-γ）（R＆D公司，美國），烏司他丁（廣州天普藥業(yè)公司）。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科實驗室提供，小牛血清（杭州四季青公司），DMEM低糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國），胰蛋白酶（Sigma，美國），MTT（Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所），彈性蛋白酶活性的檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），DMSO（Sigma，美國），細(xì)胞裂解液（碧云天，上海）。彈性蛋白酶細(xì)胞熒光探針AAPV Elastase CellProbeTMReagent（Beckman公司，美國）。流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma，美國），酶標(biāo)儀（Biotech，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備儀器廠），倒置顯微鏡（Olympus，日本），低速離心機（賽特湘儀，湖南）。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的培養(yǎng)和中性粒細(xì)胞的制備 HUVECs用含10％小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。待細(xì)胞融合后，用0.25％胰蛋白酶消化。鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓時棄去消化液，加入培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的作用。用滴管吹打壁上的細(xì)胞，使其完全脫落并分離。根據(jù)實驗需要按2×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞融合后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，然后即可進行分組實驗。

肝素化全血采自自愿者，中性粒細(xì)胞的分離采用鄒常春方法[7]簡述如下：將肝素抗凝血3 ml，置于特制的細(xì)長試管，2 000 r/min離心10 min。血液分為淡黃色血漿層和白色的白細(xì)胞層以及紅細(xì)胞層，分別吸取血漿和白細(xì)胞，置于潔凈試管中。在離心管中依次加入1 ml 1.090 g/ml Percoll和1 ml 1.077g/ml Percoll，再將1～2 ml白細(xì)胞懸液緩緩鋪在Percoll液密度梯度溶液上，2 000 r/mim離心15 min。吸取第2和第3層之間的細(xì)胞層，用自體血漿洗滌2次，加入適量DMEM培養(yǎng)液孵育10 min，瑞氏-吉姆薩染色法和臺盼藍染色法檢驗細(xì)胞的純度和存活率均在97％以上。

1.3 MTT法檢測不同濃度烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)HUVECs損傷后細(xì)胞存活率的影響 中性粒細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷需要內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞處于激活狀態(tài)[8-9]。

1.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞的激活 采用TNF-α（100 ng/ml）和IFN-γ（100 ng/ml）共同孵育12 h獲得，采用DMEM培養(yǎng)基洗滌4次后，進行實驗。

1.3.2 中性粒細(xì)胞的激活 正常健康人血液一般采用TNF-α（10 ng/ml）孵育5 min獲得，DMEM培養(yǎng)基洗滌4次后，制成2.0×106/ml的細(xì)胞懸液，進行實驗，每孔加入中性粒細(xì)胞1×104，37℃，5％CO2孵育12 h，觀察中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。

1.3.3 實驗分組 共分為10組，每組8個復(fù)孔。對照組1：HUVECs不進行活化處理，DMEM孵育12 h；對照組2：HUVECs進行活化處理，DMEM孵育12 h；對照組3：HUVECs不進行活化處理，加入未活化中性粒細(xì)胞孵育12 h；對照組4：HUVECs進行活化處理，加入未活化中性粒細(xì)胞孵育12 h；損傷組：HUVECs進行活化處理，加入活化中性粒細(xì)胞孵育12 h；烏司他丁保護組（分為5組）：烏司他丁的劑量分別為100、500、1 500、3 000和5 000 U/ml，HUVECs進行活化處理，加入活化中性粒細(xì)胞，同時加入相應(yīng)劑量的烏司他丁，孵育12 h。孵育完成后，收集培養(yǎng)液用于其它檢測。加入DMEM培養(yǎng)液（100 μ1）和含0.5％MTT的培養(yǎng)液（10 μl），37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μl的DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，同時用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定吸光值（OD值），實驗重復(fù)3次。

1.4 培養(yǎng)液中LDH、NO含量和彈性蛋白酶活性的測定

1.4.1 LDH試劑盒購至南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說明書對上述收集到的培養(yǎng)液進行LDH含量檢測。實驗重復(fù)3次。

1.4.2 以Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量[10]。方法簡述如下：100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液與100 μl的Griess試劑（1％磺胺溶于2.5％磷酸與等體積的0.1％萘乙二胺鹽酸鹽混合液）在室溫下反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上于540 nm測定吸光度。根據(jù)NaNO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量。實驗重復(fù)3次。

1.4.3 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性采用顯色性底物方法檢測，彈性蛋白酶將其特異性底物N-methoxysucciny-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide分解后，釋放出p-nitroanilide，即可在分光光度計測定其含量[11]。方法簡述如下：培養(yǎng)上清液400 g離心10 min后，加入含有顯色底物和NaCl（0.5M）的Tris-HCl（0.1 mM）緩沖液，37℃孵育10 min，0.1M NaOH終止反應(yīng)，彈性蛋白酶消化底物釋放出的p-nitroanilide的含量在405 nm波長分光光度計下檢測。以損傷組的平均OD值為1，其它各組培養(yǎng)液中彈性蛋白酶的活性表示為1的倍數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.4.4 流式細(xì)胞儀測定中性粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶活性 中性粒細(xì)胞采用TNF-α活化5 min，PBS洗滌后，分為6組，對照組和烏司他丁100、500、1 500、3 000和5 000U/ml組，每組6個樣本。37℃下DMEM培養(yǎng)液孵育1 h。PBS洗滌3次，重新懸浮在PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/ml，加入彈性蛋白酶細(xì)胞熒光探針，37℃下孵育10 min。熒光探針轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，與細(xì)胞中的彈性蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，釋放出熒光物質(zhì)rhodamine 110。設(shè)定流式細(xì)胞儀門控參數(shù)為中性粒細(xì)胞群，細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶含量以通過FL1濾光鏡的熒光強度判定。數(shù)據(jù)由CellQuest（Becton Dickinson）軟件采集。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示，采用Mann-Whitney檢驗進行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 烏司他丁對中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用 MTT法檢測與單純DMEM孵育組相比，僅僅采用TNF-α和IFN-γ活化HUVECs、未活化的HUVECs與激活的或者未激活的中性粒細(xì)胞共孵育，活化的HUVECs與未激活的中性粒細(xì)胞共孵育，都不能引起顯著的內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降，只有激活的中性粒細(xì)胞與活化的HUVECs共孵育可以引起顯著的內(nèi)皮細(xì)胞存活率下降。烏司他丁對激活中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的活化內(nèi)皮細(xì)胞的損傷的保護作用具有劑量依賴性，1 500 U/ml以上的烏司他丁可以產(chǎn)生顯著的保護效應(yīng)，見圖1。

圖1 MTT法檢測不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較

2.2 LDH含量 各組細(xì)胞處理后檢測培養(yǎng)液中的LDH含量，與單純DMEM孵育組相比，僅僅采用TNF-α和IFN-γ活化HUVECs、未活化的HUVECs與激活的或者未激活的中性粒細(xì)胞共孵育，活化的HUVECs與未激活的中性粒細(xì)胞共孵育，都不能引起培養(yǎng)液中LDH含量顯著上升，只有激活的中性粒細(xì)胞與活化的HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中LDH含量的顯著升高。500 U/ml的烏司他丁即可有效抑制激活中性粒細(xì)胞與活化HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中LDH的升高，且烏司他丁的抑制效果具有劑量依賴性，見圖2。

圖2 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量比較

2.3 NO含量 各組細(xì)胞處理后檢測培養(yǎng)液中的NO含量，與單純DMEM孵育組相比，未活化的HUVECs與激活的或者未激活的中性粒細(xì)胞共孵育不能顯著降低培養(yǎng)液中的NO含量，而采用TNF-α和IFN-γ活化HUVECs，及活化的HUVECs與未激活的中性粒細(xì)胞共孵育，都能引起培養(yǎng)液中NO含量顯著升高，激活的中性粒細(xì)胞與活化的HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中NO含量的顯著下降。500 U/ml的烏司他丁即可有效抑制激活中性粒細(xì)胞與活化HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中NO含量下降，且烏司他丁的抑制效果具有劑量依賴性，見圖3。

圖3 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量比較

2.4 彈性蛋白酶活性 各組細(xì)胞處理后檢測培養(yǎng)液中的彈性蛋白酶的活性，與單純DMEM孵育組和活化HUVECs組的培養(yǎng)液中幾乎檢測不到彈性蛋白酶的活性，未活化的HUVECs與激活的或者未激活的中性粒細(xì)胞共孵育培養(yǎng)液中含有很少的彈性蛋白酶活性，激活中性粒細(xì)胞與活化的HUVECs共孵育可以引起培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性顯著升高。500 U/ml的烏司他丁即可有效抑制激活中性粒細(xì)胞與活化HUVECs共孵育引起的培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性，且烏司他丁的抑制效果具有劑量依賴性，見圖4。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測TNF-α激活中性粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶活性 為了檢測不同劑量烏司他丁對TNF -α激活中性粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶活性的影響，100～5 000 U/ml的烏司他丁加入到TNF-α激活中性粒細(xì)胞懸液中孵育1 h后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶的活性，顯示為各組細(xì)胞的熒光密度。結(jié)果顯示，烏司他丁可以劑量依賴性降低激活中性粒細(xì)胞中彈性蛋白酶的活性，見圖5。

圖4 不同處理組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中彈性蛋白酶活性比較

圖5 烏司他丁劑量依賴性降低TNF-α激活的中性粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶活性

3 討 論

人類中性粒細(xì)胞是多種炎癥反應(yīng)性疾病，如風(fēng)濕病、成人呼吸窘迫綜合征（ARDS）、臟器缺血再灌注損傷等病理過程中，造成組織損傷的主要效應(yīng)成分[12]。內(nèi)皮細(xì)胞在這些疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中是最初的也是最重要的靶細(xì)胞，因為中性粒細(xì)胞要發(fā)揮其損傷作用，必須首先作用于內(nèi)皮細(xì)胞。系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，ARDS和多臟器衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中都有激活中性粒細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的發(fā)生[13-14]，中性粒細(xì)胞中釋放出的活性氧物質(zhì)和蛋白酶協(xié)同作用，造成內(nèi)皮損傷[15-16]。目前已經(jīng)有多種絲氨酸蛋白酶抑制劑用于臨床胰腺炎、DIC和心血管疾病的治療[17-20]。到目前為止，烏司他丁是其中臨床應(yīng)用最多，而且研究最深入的一種蛋白酶抑制劑。過去有研究表明烏司他丁可以抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的牛頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞和HUVECs損傷[21-22]，但是對于其具體機制的探索還不夠深入，特別是烏司他丁對中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制在這個過程中的作用還不完全清楚。

本研究提示烏司他丁在體外實驗中可以抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這種作用可能是通過烏司他丁對中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的抑制實現(xiàn)的。本研究的結(jié)果表明，烏司他丁不但對釋放到細(xì)胞外的彈性蛋白酶活性有抑制作用，而且對激活的中性粒細(xì)胞內(nèi)的彈性蛋白酶具有抑制作用。烏司他丁是否具有抑制中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶的作用，本研究的結(jié)果還不能證實，而且本研究的結(jié)果并不能排除烏司他丁通過其它途徑發(fā)揮其抗損傷效應(yīng)。有研究表明，烏司他丁也可以抑制白細(xì)胞介素-1（IL-1）和TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞-中性粒細(xì)胞黏附[23]，以及TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞上細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達[24]。所以烏司他丁抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷還可能是通過抑制中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附來實現(xiàn)。

人體中有多種內(nèi)源性的蛋白酶抑制劑，其中α1蛋白酶抑制劑（α1-protease inhibitor，A1PI）可以與彈性蛋白酶形成復(fù)合物，從而抑制游離彈性蛋白酶的活性[1，12]。但是，激活的中性粒細(xì)胞會釋放出活性氧物質(zhì)，能夠?qū)1PI氧化滅活。在生理狀態(tài)下，彈性蛋白酶與A1PI處于平衡狀態(tài)，在病理情況下，異常激活的中性粒細(xì)胞會打破這種平衡，彈性蛋白酶釋放出來并出現(xiàn)不可控制的酶學(xué)消化作用[1，12]，從而造成組織損傷。據(jù)報道，烏司他丁可以降低中性粒細(xì)胞釋放活性氧物質(zhì)[25]，因此，烏司他丁的保護效果可能部分來源于對內(nèi)源性蛋白酶抑制劑A1PI的保護作用。但是，一旦中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞或者細(xì)胞外基質(zhì)黏附，A1PI就不能擴散到黏附緊密的區(qū)域，彈性蛋白酶引起的組織消化和破壞進程就會加速[1，12]。外源性的蛋白酶抑制劑，如烏司他丁，也不太可能彌散進入黏附緊密的區(qū)域并使彈性蛋白酶失活。本研究顯示，烏司他丁通過直接作用于中性粒細(xì)胞而抑制其細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶的活性，說明即使中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了黏附，烏司他丁也可以抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生和釋放活化的彈性蛋白酶，對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護作用。

有研究表明，烏司他丁可以抑制心肺復(fù)蘇患者循環(huán)中中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶[26]。烏司他丁還可以通過其胰蛋白酶抑制功能區(qū)對細(xì)胞膜的作用，抑制中性粒細(xì)胞鈣離子的內(nèi)流[27-28]，進而抑制已經(jīng)激活的中性粒細(xì)胞的功能，但是本研究并沒有對這種機制進行探索。多種細(xì)胞上均有烏司他丁受體[29]，外源性烏司他丁可以被培養(yǎng)細(xì)胞通過內(nèi)吞途徑內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)[30]，因此，中性粒細(xì)胞可能也會攝取烏司他丁，從而發(fā)揮其抑制烏司他丁釋放彈性蛋白酶的作用。

總之，本研究采用體外實驗?zāi)Ｐ蛯跛舅∫种浦行粤＜?xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷機制進行了初步探索，表明烏司他丁即可能通過抑制中性粒細(xì)胞分泌到細(xì)胞外彈性蛋白酶活性，也可能通過抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)的彈性蛋白酶活性發(fā)揮其保護作用。提示，臨床上使用烏司他丁對于多種中性粒細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)性疾病如系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，ARDS等多種疾病具有一定的治療作用。

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Inhibitory effect of ulinastatin on neutrophil mediated endothelial cell injury

Wei Yi-jun，Duan Wei-xun，Xiong Hong-yan，Lei Lan-ping，Yang Yang，Chen Tao，Jin Zhen-xiao Department of Cardiovascular Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China

Jin Zhen-xiao，Email：jinzx10262＠aliyun.com

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of ulinastatin on neutrophil mediated endothelial cell injury and its underlying mechanisms.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were activated with TNF-α and IFN-γ in vitro.Neutrophil cells obtained from health people were separated and primed with TNF-α.In vitro neutrophil mediated endothelial cell injury model was established by activated HUVECs and primed neutrophial co-culture，serial concentrations（100，500，1500，3000 and 5000 U/ml）of ulinastatin were added to the co-culture system.Cellular viability was determined with MTT assay，lactate dehydrogenase（LDH）content，NO content and elastase activity in the culture medium were examined.Meanwhile，serial concentrations of ulinastatin were added to TNF-α primed neutrophial cells，and the intracellular elastase activity was measured with a flow cytometer.ResultsThe co-culture process of primed neutrophil and activated HUVECs significantly decreased the viability of HUVECs，decreased the NO content and increased the LDH and elastase content in the culture medium.Ulinatatin inhibited these changes in a dose dependent manner when added in the co-culture system.Furthermore，TNF-α alone could activate the neutrophil and increased the intracellular elastase activity，and ulinastatin could decrease the intracellular elastase activity in a dose dependent manner.ConclusionUlinastatin can dose-dependently inhibit the neutrophil mediated endothelial cell injury in an ex vivo model，this inhibitory effect is associated with the ability of ulinastatin decreasing the intracellular and extracellular elastase activity.

Ulinastatin；Endothelial cell；Neutrophil；Elastase

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0242-06

2013-06-04）

2013-07-15）

陜西省攻關(guān)計劃項目（2012SF2-21-1，2012K15-02-01）；天普研究基金項目（01201104）

721004寶雞，解放軍第三醫(yī)院神經(jīng)外科（魏毅君），710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科（魏毅君，段維勛，雷蘭萍，楊 陽，陳 濤，金振曉），710003西安，西安市中心醫(yī)院胸心外科（熊紅燕）

金振曉，Email：jinzx10262＠aliyun.com