犬瘟熱的診斷與預(yù)防研究進(jìn)展

馬天翔，肖建華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

犬瘟熱（CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種高發(fā)傳染病，宿主范圍包括大部分食肉目動(dòng)物[1]。CDV可以感染不同器官和組織的上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，與造血中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)感染有關(guān)。常規(guī)免疫接種在正常情況下是一種高度有效的預(yù)干細(xì)胞，引發(fā)全身型或神經(jīng)型的臨床過(guò)程，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴組織中形成持續(xù)感染，免疫抑制和脫髓鞘性腦脊髓炎是代表性的病癥。據(jù)報(bào)道，犬瘟熱在法國(guó)、德國(guó)、美國(guó)、日本和芬蘭等常規(guī)免疫執(zhí)行很好的國(guó)家仍然會(huì)發(fā)生流行，表明預(yù)防接種過(guò)的犬也可能發(fā)病，而其發(fā)病機(jī)制亦可能存在新的變化[2-4]。犬瘟熱作為犬的重要傳染病，可表現(xiàn)為多種復(fù)雜癥狀，由于其典型的雙相熱型在近期的臨床病例中并不常見(jiàn)，致使臨床確診較為困難。因此，實(shí)驗(yàn)室診斷CDV是非常必要的。

1 犬瘟熱的診斷

1.1 病毒的分離與鑒定

CDV分離培養(yǎng)是確診該病的最根本方法，但工作量較大，且CDV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很弱，其脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)較脆弱，易被光和熱滅活，致使病毒分離成功率較低。分離CDV用的組織細(xì)胞有原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系兩大類(lèi)。原代培養(yǎng)細(xì)胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、腎細(xì)胞等[5]。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺臟巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分離CDV的傳代細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系（MDCK）、狗腎細(xì)胞系（DK）、非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）等多種細(xì)胞系。 用Vero 細(xì)胞分離培養(yǎng)CDV被認(rèn)為是首選細(xì)胞。近年來(lái)用來(lái)源于犬惡性組織細(xì)胞增多癥的組織細(xì)胞建立的細(xì)胞系CCT 細(xì)胞培養(yǎng)CDV獲得了成功[6]。

分離后的病毒通?？梢越Y(jié)合電鏡檢查、動(dòng)物回歸試驗(yàn)以及病毒特異性抗原和特異性核酸診斷試驗(yàn)等方法對(duì)病毒進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。在進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)時(shí)，各種接種途徑均可使雪貂、犬和水貂發(fā)生具有臨床癥狀的感染，電鏡觀察是檢查、確定CDV感染最簡(jiǎn)便快速的方法。遇秀玲等報(bào)道，采用電鏡技術(shù)對(duì)CDV93039 株和CDVMD—77 株在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的增殖過(guò)程和所致病變特點(diǎn)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)CDV93039 株少見(jiàn)長(zhǎng)絲狀核衣殼聚集及典型的胞膜上出芽病毒粒子，包涵體以電子致密小體為主：CDVMD—77 株可見(jiàn)成堆存在的核衣殼結(jié)構(gòu)，胞膜上出芽增殖明顯可見(jiàn)，包涵體以核衣殼結(jié)構(gòu)聚集為主，后期也有電子致密小體[7]。房紅瑩等對(duì)臨床診斷為犬瘟熱的14 例病犬，取腦組織，運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、合胞體檢查、包涵體檢查、免疫熒光試驗(yàn)、電鏡觀察5種檢測(cè)方法，就犬瘟熱的微生物學(xué)診斷進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，建立的改良離子捕獲電鏡法用于檢測(cè)犬腦勻漿和犬腦接種細(xì)胞培養(yǎng)物，與離子捕獲電鏡法、免疫電鏡法及直接電鏡法相比效果更為理想[8]。但采用電鏡對(duì)病毒進(jìn)行鑒定時(shí)只能觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，很難與同科的病毒相區(qū)別。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定技術(shù)的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但分離過(guò)程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，并且在病后期由于中和抗體的出現(xiàn)很難分離到病毒。

1.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 熒光抗體技術(shù)

楊百亮等建立了用于檢測(cè)犬瘟熱病毒的間接熒光抗體染色法，試驗(yàn)確定了1∶80 稀釋的抗犬瘟熱單克隆抗體和32倍稀釋的熒光素標(biāo)記羊抗鼠IgG為適宜的工作濃度，對(duì)自然感染犬的眼分泌物、鼻汁、糞便和血涂片CDV檢出率分別為21%、14%、15%和76%，說(shuō)明熒光抗體技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、快速、特異的檢測(cè)犬瘟熱的方法[9]。岳妙姝將犬瘟熱病毒純化后免疫雌性BALB/c 小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)克隆和間接ELISA篩選，獲得6株穩(wěn)定分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，采用G蛋白親和層析柱對(duì)腹水進(jìn)行純化，將純化后的單抗腹水用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記制備熒光抗體，并對(duì)該熒光抗體進(jìn)行鑒定，吸收試驗(yàn)、阻斷試驗(yàn)和與犬細(xì)小病毒（CPV）、輪狀病毒（RV）及犬腺病毒（CAV）的交叉試驗(yàn)表明，所制備的熒光抗體具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)；應(yīng)用該技術(shù)制備的單克隆抗體對(duì)感染CDV的細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，該單克隆抗體顯示了對(duì)CDV的高特異性，用該抗體制備的熒光抗體在對(duì)CDV的實(shí)驗(yàn)室診斷中具有快速和特異性高的特點(diǎn)[10]。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

李娜建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA）的診斷方法以檢測(cè)CDV血清抗體水平，通過(guò)測(cè)定CDV抗原包被的最佳濃度、血清的最佳稀釋度、酶標(biāo)HRP 二抗的最適工作濃度等優(yōu)化試驗(yàn)，選擇間接ELISA最佳的反應(yīng)條件，試驗(yàn)結(jié)果表明，抗原的最佳包被濃度為0.525 μg·100 μL-1，最適血清稀釋度為1∶40，酶標(biāo)HRP 二抗的最適工作濃度為 1∶2000[11]。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

任文陟等用CD 雞胚成纖維細(xì)胞弱毒疫苗免疫綿羊制備瓊脂擴(kuò)散抗體，建立了瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法[12]。雖然只能粗略地對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定，靈敏性較差，但不需要特殊儀器，操作簡(jiǎn)單，適宜在基層臨床中推廣。

1.2.4 膠體金試紙條法

膠體金試紙條法是基于單克隆抗體建立的診斷技術(shù)。An 等利用獲得的2 株單克隆抗體建立了膠體金試紙條診斷技術(shù)，并用巢式PCR 進(jìn)行比較，雖然敏感性（89.7%和85.7%）和特異性（94.6%和100%）略低，但其使用方便，造價(jià)低廉，所以更容易在臨床上推廣[13]。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）診斷法比傳統(tǒng)診斷法具有更高的敏感性和特異性，尤其在犬瘟熱發(fā)病早期，機(jī)體尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答時(shí)，RTPCR診斷法便能夠作出早期診斷，有利于及早地確診經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（貂、狐貍和貉子）及野生保護(hù)動(dòng)物（獅、虎和豹）等是否感染了犬瘟熱病毒，以便采取有效的防治措施，這對(duì)降低經(jīng)濟(jì)損失、保護(hù)生態(tài)平衡具有重要意義[14]。鞠會(huì)艷等針對(duì)犬瘟熱病毒N和H蛋白的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了來(lái)自不同地區(qū)的水貂、狐貍、貉子和老虎病料中犬瘟熱病毒的感染情況，研究結(jié)果表明，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)病料中犬瘟熱病毒的檢測(cè)具有科學(xué)性和可信度[15]。Stanton 等對(duì)半巢式PCR 方法和免疫熒光法、病理組織學(xué)方法及免疫組化法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)半巢式PCR 方法更適于發(fā)病后的檢測(cè)，能夠在區(qū)別疫苗株和流行株[16]。

1.4 包涵體檢查

包涵體主要存在于膀胱、膽管、膽囊和腎盂上皮細(xì)胞內(nèi)，大多存在于胞漿內(nèi)，一般呈現(xiàn)圓形或橢圓形。但CDV形成的包涵體難以與狂犬病病毒等所形成的包涵體及類(lèi)似物區(qū)分，因此確診犬瘟熱需要與其他方法相結(jié)合。

2 犬瘟熱的預(yù)防

2.1 定期接種疫苗

幼犬首免在45～50日齡進(jìn)行，每隔21～28 d 加強(qiáng)免疫1次，連續(xù)免疫3次（如犬首免時(shí)間在3月齡以上，可按上述程序連續(xù)免疫2 次），以后每年加強(qiáng)免疫1次。疫苗目前主要用進(jìn)口的犬二聯(lián)苗、五聯(lián)苗、六聯(lián)苗或七聯(lián)苗。免疫時(shí)同時(shí)注射免疫增強(qiáng)劑（胸腺肽等），免疫效果會(huì)更好。如犬場(chǎng)曾發(fā)生過(guò)犬瘟熱、細(xì)小病毒病等疫情，建議在幼犬出生后28日齡免疫1次犬小二聯(lián)苗（犬瘟熱和細(xì)小病毒二聯(lián)疫苗）。

2.2 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

每周1 次對(duì)犬舍以3%燒堿溶液或10%福爾馬林消毒。定時(shí)定量飼喂，并給予充足的飲水，圈舍要通風(fēng)干燥，同時(shí)每天進(jìn)行適量的戶(hù)外運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。發(fā)現(xiàn)病犬或疑似病犬應(yīng)及時(shí)隔離、治療，預(yù)防繼發(fā)感染，對(duì)無(wú)治療價(jià)值的進(jìn)行撲殺或?qū)嵤┌矘?lè)死，實(shí)行無(wú)害化處理。各養(yǎng)殖場(chǎng)盡量做到自繁自養(yǎng)，防止外來(lái)疫源傳入。

3 小 結(jié)

熒光抗體技術(shù)、ELISA、膠體金試紙條法與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)相比，具有敏感、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外相繼建立起CDV核酸雜交和RT-PCR 檢測(cè)法，其方法比免疫學(xué)檢測(cè)法具有更高的敏感性和特異性，尤其在CDV感染早期，尚未產(chǎn)生免疫應(yīng)答的情況下RT-PCR 檢測(cè)法便能夠作出早期診斷。但犬瘟熱的預(yù)防也不容忽視，只有定期接種疫苗、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，才能控制犬瘟熱的發(fā)生。

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