臍血間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病治療的研究進(jìn)展

蘆 倩 宮殿榮

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271016;2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東聊城 252000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenechymal steme cell，MSC)是來(lái)源于中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有全能干細(xì)胞的特點(diǎn)，能夠多向分化，在適合的條件下可分化為多種細(xì)胞，尤其可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志nestin及神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志，甚至出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣電活動(dòng)［2］。臍血作為MSC的來(lái)源之一具有含量較豐富，易于采集與保存，且不存在倫理問(wèn)題，與骨髓相比，MSCs具有來(lái)源充足免疫原性更弱等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)示臍血比骨髓間質(zhì)干細(xì)胞有更廣闊的應(yīng)用前景。應(yīng)用臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病(DEACMP)較傳統(tǒng)方法有很多優(yōu)點(diǎn)，如低毒性或無(wú)毒性，長(zhǎng)期有效;下面就臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療DEACMP研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MSC的起源及定義

1976年，在骨髓培養(yǎng)過(guò)程中，F(xiàn)riedenstein等首次發(fā)現(xiàn)了一種呈梭形并有突起的貼壁細(xì)胞，可分化為類(lèi)似骨或軟骨的集落，隨后發(fā)現(xiàn)，此類(lèi)細(xì)胞有多向分化的潛能，在特定條件下甚至可以定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，這種骨髓起源的間質(zhì)干細(xì)胞命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenechymal steme cell，BMMsC)。后來(lái)，研究者又在胎肺、胎腎、外周血、臍帶等多個(gè)部位分離出這種具有貼壁能力、梭形、能夠多次傳代、多向分化潛能的干細(xì)胞，與BMMSC具有相似的生物學(xué)特性，也屬于MSC。

2 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞

2000年，Erices 8首先報(bào)道了從臍血中分離出成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，能夠表達(dá)細(xì)胞表面抗原SHZ、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29 和 CD49e，與骨髓來(lái)源MSC相同，他認(rèn)為這種細(xì)胞也屬于間充質(zhì)干細(xì)胞。其后，陸續(xù)有研究小組報(bào)道從臍血單個(gè)核細(xì)胞中分離出貼壁細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)粘附分子CD13+、CD29+及CD44+，但不表達(dá)造血干細(xì)胞特異性抗原，其細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式、生物學(xué)特性與骨髓來(lái)源MSC相似。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，臍血的多能干細(xì)胞建系需時(shí)較長(zhǎng)，前體細(xì)胞出現(xiàn)頻率明顯較骨髓低，骨性抗原表達(dá)水平低，無(wú)持續(xù)表達(dá)的神經(jīng)抗原。提示該類(lèi)前體細(xì)胞可能比骨髓MSC更原始。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)在神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)介質(zhì)中經(jīng)7～10 d的誘導(dǎo)，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的特異性表型，提示可用作神經(jīng)前體細(xì)胞的替代來(lái)源［3］。可見(jiàn)，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞有更多生物學(xué)特性和功能有待我們?nèi)パ芯?。而且，臍帶血存在于胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后廢棄的胎盤(pán)和臍帶中，因此來(lái)源廣泛，不受倫理學(xué)等約束;另外，臍帶血干細(xì)胞具有人類(lèi)白細(xì)胞抗原配型相合程度要求低、傳染病毒風(fēng)險(xiǎn)低、移植后嚴(yán)重排斥發(fā)生率較低等特性，這些都預(yù)示著臍血間充質(zhì)干細(xì)胞將具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。

3 神經(jīng)干細(xì)胞

Mckay于1997年正式提出了神經(jīng)干細(xì)胞的概念:神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSCs)是具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞。1992年首次從成年小鼠腦紋狀體中分離出能在體外不斷分裂增殖，且具有多種分化潛能的細(xì)胞群。隨后的很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室壁的腦室下層(subven-tricular zone，SVZ)、海馬齒狀回顆粒下層(subgranular proliferative zone，SGZ)、室管膜區(qū)、大腦皮質(zhì)、嗅球、紋狀體、間腦、小腦、脊髓和視網(wǎng)膜均分離到神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞具有以下特性:① 可生成神經(jīng)組織或來(lái)源于神經(jīng)系統(tǒng);②在一定條件下能不斷進(jìn)行有絲分裂，以滿(mǎn)足神經(jīng)多樣性的需要;③多潛能分化，同時(shí)又能自我更新;④低免疫原性，神經(jīng)細(xì)胞是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟細(xì)胞抗原，較少發(fā)生異體排異反應(yīng)，有利于其存活。

4 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病

4.1 DEACMP目前研究進(jìn)展

DEACMP是指急性一氧化碳中毒昏迷后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間清醒(3～30 d)，再次出現(xiàn)意識(shí)障礙、精神癥狀、震顫等系列癥狀，主要表現(xiàn)為癡呆、定向力下降、行為異常、震顫、偏癱、頭疼、失眠、乏力、記憶力減退、大小便失禁等［4］。病理改變主要為大腦白質(zhì)的廣泛髓鞘脫失，蒼白球出現(xiàn)對(duì)稱(chēng)性軟化灶。目前DEACMP的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近年來(lái)，人們一直進(jìn)行各種探索，如缺血缺氧機(jī)制，細(xì)胞毒性損傷機(jī)制，再灌注損傷和自由基機(jī)制，興奮性氨基酸機(jī)制，免疫功能異常和神經(jīng)遞質(zhì)紊亂機(jī)制，神經(jīng)凋亡機(jī)制等。目前臨床主要以改善腦循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)合高壓氧及對(duì)癥治療為主，然而使用神經(jīng)節(jié)苷脂、依達(dá)拉奉和多奈哌齊等藥物對(duì)DEACMP患者的預(yù)后無(wú)明顯影響［5］，高壓氧治療也僅能縮短CO的半排出期，促進(jìn)排除CO，增加血液中的氧含量，改善組織修復(fù)環(huán)境，只在CO中毒急性期作用顯著，對(duì)DEACMP治療只起輔助作用［6］。近年來(lái)，不少研究表明，CO中毒后期持續(xù)使用HBO治療CO中毒，以及使用HBO治療遲發(fā)性腦病，理論依據(jù)均不足［7］，更有研究指出長(zhǎng)期HBO能導(dǎo)致氧中毒，加重病情進(jìn)展。干細(xì)胞的出現(xiàn)無(wú)疑為DEACMP的治療開(kāi)辟了新空間。

4.2 神經(jīng)干細(xì)胞在治療DEACMP中的作用

研究發(fā)現(xiàn)腦損傷時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞能被激活，發(fā)生增殖、遷徙并分化［8］。SVZ的干細(xì)胞沿嘴側(cè)遷移路徑(rostral migratory stream，RMS)遷移至嗅球，分化發(fā)育成新的中間神經(jīng)元并進(jìn)一步建立起神經(jīng)連接;SGZ的干細(xì)胞則發(fā)育形成另一種不同類(lèi)型的神經(jīng)元-顆粒細(xì)胞，并與海馬齒狀回建立突觸聯(lián)系。腦組織損傷、缺血、生長(zhǎng)因子等引起了腦內(nèi)某些因子變化，通過(guò)不同途徑作用于神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖、分化和遷移，增殖分化的神經(jīng)元部分代替和修復(fù)受損的神經(jīng)元，對(duì)損傷產(chǎn)生可塑性反應(yīng)。而腦損傷后僅調(diào)動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞自我修復(fù)是有限的，不僅神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量不足，而且某些調(diào)節(jié)遷移、分化、存活、神經(jīng)元修復(fù)和突觸形成的因子也不足，導(dǎo)致自體干細(xì)胞其修復(fù)能力有限。然而臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患病例中，原位神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中，并未發(fā)揮自我修復(fù)作用。其可能原因有:①原位誘導(dǎo)出功能特異的神經(jīng)元可能需要多種刺激和特定細(xì)胞因子的作用。②患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞缺陷或無(wú)法激活。因此神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和體外培養(yǎng)成功及移植治療，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)病的細(xì)胞替代療法拓寬了道路。雖然如上所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代治療最理想的種子細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞，但神經(jīng)干細(xì)胞取材困難，特別是胎腦的來(lái)源有限，還受到倫理和法律的束縛，限制了其臨床的應(yīng)用。

4.3 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療DEACMP的研究

4.3.1 移植途徑和方法

UCB-MSCs移植的途徑有:通過(guò)腦立體定位儀將UCB-MSCs注入側(cè)腦室、紋狀體、海馬等;直接注射入腦室或蛛網(wǎng)膜下腔，通過(guò)腦脊液的流動(dòng)將細(xì)胞帶到病變部位;注射入靜脈或動(dòng)脈，使其通過(guò)血腦屏障到達(dá)病變部位，主要應(yīng)用于鼠尾靜脈注射。UCB-MSCs移植治DEACMP的方法主要有:一是將未誘導(dǎo)或修飾過(guò)的UCB-MSCs直接移植入體內(nèi)，利用體內(nèi)環(huán)境的信號(hào)誘導(dǎo)分化為合適的細(xì)胞。另外一種方法是移植經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)或因修飾過(guò)的UCB-MSCs，使其分化為所需要的神經(jīng)細(xì)胞后再移植入體內(nèi)。

4.3.2 移植的影響因素

UCB-MSCs的選取、分離培養(yǎng)方法，分化為神經(jīng)細(xì)胞的效率，移植細(xì)胞的類(lèi)型、數(shù)量、合適的比例、合適的移植位點(diǎn)，UCB-MSCs對(duì)細(xì)胞外環(huán)境的影響以及細(xì)胞外環(huán)境對(duì)UCB-MSCs的影響，腦中內(nèi)源性因子的作用以及UCB-MSCs在腦內(nèi)存活時(shí)間對(duì)移植療效均有一定的影響。Karen等發(fā)現(xiàn)，UCB-MSCs分離較為合適的條件是，樣本保存時(shí)間不超過(guò)15 h，樣本中血液體積要超過(guò)33 ml，并且血液中沒(méi)有血凝塊和胰酶，單份血液中的 MSC要超過(guò) 108。Buzanska等將貼壁后的UCB-MSCs在含EGF培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周，獲得nestin陽(yáng)性的細(xì)胞集落，隨后將這種細(xì)胞分別用多聚左旋賴(lài)氨酸、視黃酸和BDNF誘導(dǎo)，可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞;若與大鼠腦原代培養(yǎng)單層細(xì)胞共培養(yǎng)，也可獲得神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

4.3.3 UCB-MSCs治療DEACMP的可能機(jī)制

①UCB-MSCs本身所具有復(fù)雜精細(xì)的控制系統(tǒng)，可以防止蛋白質(zhì)的錯(cuò)構(gòu)和聚集，如分子伴侶促進(jìn)適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊，防止非天然的蛋白質(zhì)聚集［9］。醫(yī)療控制可以使處于錯(cuò)構(gòu)的蛋白質(zhì)被泛素蛋白酶小體系統(tǒng)以及吞噬體溶酶體系統(tǒng)降解，尤以泛素蛋白酶小體系統(tǒng)重要，從而阻止疾病病程的進(jìn)展［10-11］。②UCB-MSCs可以定位包繞在病變組織的周?chē)⑿纬删W(wǎng)絡(luò)修復(fù)壞損的神經(jīng)組織，使患者能夠恢復(fù)喪失的神經(jīng)功能［12］。③UCB-MSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境下能分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)因子，或者刺激損傷部位產(chǎn)生內(nèi)源性因子，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)并減少細(xì)胞凋亡。④UCB-MSCs移植入腦后，能形成表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志性蛋白的神經(jīng)元樣細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生的細(xì)胞可在受損部位周?chē)婊钌踔烈菩兄寥X［13］。⑤UCBMSCs可分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，幫助神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)血管發(fā)生［14］。⑥UCB-MSCs可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以營(yíng)養(yǎng)激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)分化成神經(jīng)組織細(xì)胞替代缺損細(xì)胞，即啟動(dòng)內(nèi)源性途徑修復(fù)損傷。⑦在腦內(nèi)創(chuàng)造適宜的局部微環(huán)境，通過(guò)體外擴(kuò)增或不同因子誘導(dǎo)分化的方法使UCB-MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞后進(jìn)行移植，替代受損細(xì)胞重建神經(jīng)功能區(qū)和傳導(dǎo)通路［15］。近年有研究表明，UCB-MSCs可以改善患者的自主神經(jīng)、小腦錐體外系和運(yùn)動(dòng)癥狀［16-17］。因此，其在DEACMP的臨床應(yīng)用必將得到推廣。

5 展望

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞因其來(lái)源豐富、采集方便、具備自我更新、多向分化的能力，在特定的誘導(dǎo)條件下可向其他組織分化，移植后免疫排斥反應(yīng)低等特點(diǎn)備受大家關(guān)注。目前，臨床上已用于治療脊髓損傷［18］、多系統(tǒng)萎縮［19］、帕金森氏?。?0］、腦癱患兒［21］等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并取得了顯著療效，為廣大患者帶來(lái)了希望。然而其分離、培養(yǎng)及鑒定還有許多工作要做，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化及遷移機(jī)制有待研究，移植的最佳時(shí)間窗仍有待于解決，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植的療效及安全也需進(jìn)一步評(píng)定，但相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，上述存在的問(wèn)題將逐步解決，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用將有廣闊的前景。

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