姜黃素對大鼠大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

劉莉，譚波濤，李昱，余剛

神經(jīng)元通過線粒體氧化磷酸化生成ATP來提供能量，線粒體不是靜止的細胞器，波動的內(nèi)環(huán)境和增加的內(nèi)生活性氧都會導(dǎo)致線粒體損傷，因此對細胞內(nèi)代謝物、活性氧流通、線粒體功能和數(shù)量進行動態(tài)調(diào)節(jié)非常重要[1]。腦缺血過程中很多機制都會引起神經(jīng)元線粒體功能障礙[2]。細胞內(nèi)充足的線粒體數(shù)量及活躍的線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制和合成可改變病理狀態(tài)下活性氧的增加[3-4]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是一種維持線粒體DNA復(fù)制量的核編碼蛋白[3]，是反映線粒體生物合成的重要因子[4]。研究證實，小鼠TFAM基因損傷可導(dǎo)致mtDNA損耗，影響mtDNA轉(zhuǎn)錄及其所編碼多肽的合成，造成嚴重的呼吸鏈功能障礙[5]。解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子通道轉(zhuǎn)運蛋白[6]，具有抑制線粒體活性氧生成[7]、降低線粒體電勢差[8]、限制線粒體內(nèi)Ca2+負荷[5]等作用，最終通過抑制細胞凋亡發(fā)揮保護效應(yīng)。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類物質(zhì)，具有潛在的抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11-12]等生物學(xué)效應(yīng)[8]。已有研究表明，姜黃素對大鼠大腦局灶性缺血再灌注損傷具有保護作用[13]，但其機制一直存在爭議，尤其是姜黃素對線粒體的影響鮮有報道。本研究擬通過觀察不同劑量姜黃素預(yù)處理對大鼠大腦皮質(zhì)UCP2和TFAM表達的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SD大鼠80只，體重220～300g，由大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。姜黃素(C1386，美國Sigma)用二甲基亞砜(DMSO)為溶劑配制為50mg/ml和100mg/ml兩個工作濃度。

1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機均分為假手術(shù)組，缺血再灌注(I/R)組，姜黃素高劑量、低劑量組(簡稱高、低劑量組)，每組20只。高、低劑量組于缺血前5d連續(xù)每天(最后一次于缺血前30min給藥)分別經(jīng)腹腔注射姜黃素100mg/kg和50mg/kg，假手術(shù)組和I/R組注射等體積DMSO。參照Longa等[14]的線栓改良法復(fù)制大鼠右側(cè)大腦局灶性腦缺血模型，將一直徑0.234mm的漁線經(jīng)右側(cè)頸外動脈切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進18～20mm，感到阻力時即阻斷大腦中動脈，2h后撥出魚線完成造模。假手術(shù)組僅分離暴露頸總、頸外及頸內(nèi)動脈，不予線栓插入。術(shù)后按照Longa 5分法[14]行神經(jīng)癥狀評分，癥狀不明顯(評分＜1分)的動物予以剔除。

1.3 腦組織固定及尼氏染色 再灌注24h后，麻醉動物，打開胸腔，暴露心臟，將一輸液針頭插入左心室，向主動脈方向灌入生理鹽水，同時于右心耳處剪一小口，灌注至右心房流出清亮液體，再由左心室灌入約200ml 4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定。斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定過夜。在距右側(cè)額葉前端3mm處向后(此為大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū))切成厚3～4mm的薄片，依次放入梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，包埋，切片。腦組織切片脫蠟后用蒸餾水沖洗，1%甲苯胺藍溶液室溫浸染30min；蒸餾水中沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 電鏡標本制備 灌注固定腦組織：所用灌注液為2%多聚甲醛與2%戊二醛的混合液，余步驟同前所述腦組織固定方法。在距額葉前端3mm和7mm處行冠狀切片，取中間4mm厚腦塊，沿矢狀縫線旁開4mm處，與矢狀縫所在面呈30°斜切，外側(cè)皮質(zhì)為缺血核心區(qū)。每例在內(nèi)側(cè)2mm以內(nèi)取材3塊，每塊1mm3，于4%戊二醛中固定。按常規(guī)操作進行電鏡標本制備，透射電鏡觀察神經(jīng)元內(nèi)線粒體的變化。

1.5 免疫組化染色 按照SP試劑盒說明書(北京康為世紀有限公司)進行免疫組織化學(xué)染色，所用抗體為兔抗大鼠UCP2多克隆抗體(1:200，博奧森公司)和兔抗大鼠TFAM單克隆抗體(1:100，美國Biovision)。光鏡下胞質(zhì)中棕黃色顆粒為陽性產(chǎn)物。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，美國)圖像分析系統(tǒng)測定免疫陽性產(chǎn)物的平均光密度值。

1.6 TFAM和UCP2 mRNA表達測定 按照RNAiso Plus試劑盒(D9108A，日本TaKaRa)說明書提取皮質(zhì)總RNA，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列：UCP2上游引物5'-GGTCGGAGATACCAGAGCAC-3'，下游引物5'-ATGAGGTTGGCTTTCAGGAG-3'，產(chǎn)物長度173bp；TFAM上游引物5'-ACGCCTAAAGAAGAAAGCACA-3'，下游引物5'-ACACTGCGACGGATGAGAT-3'，產(chǎn)物長度297bp；GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物長度452bp。用一步法RT-PCR試劑盒(DRR037A，日本TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計掃描，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，以UCP2和TFAM與GAPDH擴增條帶光密度的比值表示UCP2和TFAM mRNA表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，對多個樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元尼氏體丟失的影響(尼氏染色 ×400)Fig. 1 Effect of curcumin on loss of Nissl body in infarcted cortex (Nissl staining ×400)A. Sham group; B. I/R group; C. Curcumin 50mg/kg group; D. Curcumin 100mg/kg group

圖2 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響(透射電鏡 ×5000 )Fig. 2 Effect of curcumin on mitochondrial morphology of neuron in infarcted cortex (transmission electron microscope ×5000)A. Sham group; B. I/R group; C. Curcumin 50mg/kg group; D. Curcumin 100mg/kg group

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元損傷的影響 在皮質(zhì)缺血受累區(qū)域周圍，I/R組染色后可見明顯細胞水腫、空泡變性，尼氏小體顏色變淺且數(shù)目變少，甚至溶解消失。姜黃素高、低劑量組的神經(jīng)元胞核清晰，尼氏小體深染成紫藍色，核周圍顆粒大，呈塊狀或顆粒狀，高劑量組損傷程度比低劑量組輕(圖1)。

2.2 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響 假手術(shù)組大腦中動脈供血皮質(zhì)區(qū)域內(nèi)，線粒體大小、形態(tài)較一致，分布較均勻，線粒體嵴的排列規(guī)則有序。缺血再灌注損傷后，線粒體腫脹明顯，嵴紊亂、短小，甚至斷裂溶解。姜黃素預(yù)處理減輕了缺血再灌注對線粒體的損傷，線粒體嵴的減少較I/R組輕(圖2)。

2.3 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM蛋白表達的影響 免疫組化染色顯示，假手術(shù)組、I/R組、低劑量組和高劑量組的UCP2蛋白光密度值分別為0.01576±0.00021、0.00333±0.00016、0.00880±0.00032、0.01267±0.00018，TFAM蛋白光密度值分別為0.00642±0.00047、0.00215±0.00027、0.00237±0.00029、0.00295±0.00023。

由圖3可見，假手術(shù)組中由右側(cè)大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元內(nèi)UCP2陽性產(chǎn)物表達豐富，呈深棕色，而I/R組中UCP2的表達顯著下降(P＜0.05)，細胞形態(tài)也發(fā)生了變化。在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)，高、低劑量組神經(jīng)元內(nèi)UCP2的表達較I/R組明顯增多(P＜0.05)，且以高劑量組更為顯著(P＜0.05)。假手術(shù)組中相應(yīng)皮質(zhì)區(qū)可見大量TFAM陽性產(chǎn)物，缺血再灌注后TFAM表達下降(P＜0.05)。與I/R組相比，高劑量組TFAM陽性表達顯著增加(P＜0.05)，但低劑量組的表達量未見明顯增加。

2.4 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM mRNA表達的影響 假手術(shù)組、缺血再灌注組、低劑量組和高劑量組的UCP2 mRNA相對表達量分別為0.14288±0.01445、0.10488±0.00564、0.16268±0.00990、0.21475±0.01401，TFAM mRNA相對表達量分別為0.40364±0.01607、0.18951±0.01176、0.20870±0.01902、0.29472±0.02307。

由圖4可見，與假手術(shù)組比較，I/R組由大腦中動脈供血的皮質(zhì)區(qū)中UCP2和TFAM mRNA表達顯著降低(P＜0.05)。高、低劑量組UCP2 mRNA表達水平均高于I/R組(P＜0.05)，且高劑量組升高更明顯(P＜0.05)；但TFAM mRNA僅在高劑量組中較I/R組增高(P＜0.05)，低劑量組與I/R組比較無顯著差異。

圖3 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM表達的影響(SP ×400)Fig. 3 Effect of curcumin on the expressions of UCP2 and TFAM in infarcted cortex (SP ×400)

圖4 姜黃素對皮質(zhì)梗死區(qū)UCP2和TFAM的mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of curcumin on the expression of mRNA of UCP2 and TFAM in infarcted cortex M. Marker; 1. Sham group; 2. I/R group; 3. Curcumin 50mg/kg group; 4. Curcumin 100mg/kg group

3 討 論

姜黃素是從植物姜黃根莖中提取的一種可食用的多元酚，研究已證實其對腦血管疾病、神經(jīng)中毒性疾病以及阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥等多種神經(jīng)變性疾病均有治療效果[14]，本實驗旨在探討其對急性缺血性腦損傷的保護機制。Yang等[15]認為姜黃素在腦缺血再灌注損傷后通過上調(diào)抗氧化基因上游因子Nrf2發(fā)揮保護作用。Nrf2可進一步促進HO-1轉(zhuǎn)錄。HO-1是二期酶(phase Ⅱ enzymes)中的一種，可誘導(dǎo)血紅素降解，生成強效抗氧化分子膽紅素[15]，可與其他幾種二期酶(如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和NADPH)一起在體內(nèi)形成強大的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)。此外有研究認為，姜黃素可通過增加保護性蛋白Bcl-2表達，抑制下游分子細胞色素C的釋放及Caspase3的活化，從而抑制細胞凋亡[16-17]。除了抗氧化效應(yīng)，還有部分學(xué)者認為姜黃素可通過降低缺血再灌注后NF-κB和ICAM-1的表達減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕腦損傷[18]。本實驗也觀察到姜黃素預(yù)處理明顯減輕了皮質(zhì)梗死區(qū)神經(jīng)元的損傷，證實了既往研究提出的姜黃素對缺血再灌注腦損傷有保護作用這一結(jié)論[13]。

本研究還觀察到姜黃素對神經(jīng)元亞細胞器存在一定影響，如再灌注后腫脹的線粒體內(nèi)嵴排列紊亂、變短甚至溶解，而一定劑量姜黃素預(yù)處理可減輕缺血再灌注對線粒體的損傷。線粒體嵴的數(shù)量與細胞呼吸功能有關(guān)，姜黃素可能通過保護神經(jīng)元線粒體來抵抗缺血所致的呼吸功能下降，從而保護神經(jīng)元。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素能上調(diào)與線粒體關(guān)系密切的UCP2和TFAM蛋白的表達，并且與劑量相關(guān)，提示UCP2和TFAM可能是姜黃素發(fā)揮腦保護效應(yīng)的靶點。

UCP2是UCP家族中在大腦有廣泛分布的蛋白之一，是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，主要表達于細胞質(zhì)。有學(xué)者認為UCP2對腦缺血性損傷的保護作用與前炎癥因子的抑制和細胞保護因子的激活有關(guān)[19]。UCP2過表達能在一定程度上抵消缺血誘導(dǎo)的IL-6增加和Bcl-2減少[20]，還能增加細胞周期基因以及p-AKT、PKC和MEK蛋白的表達[19]。除此以外，UCP2還可能通過其他途徑來

改善缺血性腦損傷。既然UCP2是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，我們有理由推測它可能通過改善線粒體功能而發(fā)揮保護效應(yīng)。UCP2蛋白本身具有抑制線粒體活性氧生成[6]、降低線粒體電勢差[10]、限制線粒體內(nèi)Ca2+負荷[5]等作用。Andrews等[21]還報道胃促生長素可增加野生型小鼠含神經(jīng)肽Y的神經(jīng)元核周體內(nèi)的線粒體數(shù)量，而UCP2基因敲除小鼠的線粒體數(shù)量沒有增加，提示UCP2很可能有另一種鮮為人知的功能，即調(diào)控線粒體生物合成。

TFAM是反映線粒體生物合成功能的一個重要指標[22-23]，其對缺血性損傷的保護作用已有學(xué)者報道，如Ikeuchi等[24]認為心肌缺血后過表達的TFAM可抑制mtDNA拷貝數(shù)的減少，維持線粒體呼吸鏈功能，從而抵抗心肌氧化應(yīng)激損傷。類似的保護作用在腦缺血中也有報道，如Hokari等[4]發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在腦缺血再灌注后出現(xiàn)大量受損神經(jīng)元，細胞呈三角形，核周質(zhì)固縮，并伴隨神經(jīng)纖維空泡變性，而TFAM超表達的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的這種受損神經(jīng)元明顯減少。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素預(yù)處理明顯增加了大鼠皮質(zhì)梗死區(qū)TFAM陽性產(chǎn)物的表達，且與神經(jīng)元尼氏體丟失位于相同區(qū)域，提示TFAM的增加可能對缺血再灌注腦損傷起到了保護作用。

綜上，UCP2與TFAM之間可能存在一定的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，且本研究顯示UCP2蛋白與TFAM蛋白在各處理組中的變化趨勢一致，也證實了這一點，但具體機制尚需進一步研究證實。

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