淫羊藿苷對鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠附睪功能的干預(yù)作用*

宮 燕，史 杰，謝高宇，劉浩然，齊敏友△

（1．浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310014；2．貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，貴州貴陽550002；3．湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥理教研室，長沙410082）

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，可引起多種并發(fā)癥，其中之一是導(dǎo)致男性性功能低下及精子活力下降［1，2］。目前在改善糖尿病所致的生殖功能下降方面，中草藥發(fā)揮了重要的作用。淫羊藿是常用的補腎壯陽的中藥，其主要化學(xué)成份之一是淫羊藿苷。有文獻報道其提高性功能，改善睪丸功能的作用［3，4］?？紤]到精子在附睪中成熟并獲能，本實驗考察了淫羊藿苷對糖尿病大鼠附睪功能的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物 SD大鼠，雄性，180～220 g，購于浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）-2008-0033。

1．1．2 藥物及試劑 鏈脲佐菌素（STZ），Sigma公司提供，批號：110203。羅格列酮，購于浙江萬馬合成藥有限公司，批號：101206；淫羊藿苷，由西安小草植物科技有限公司提供，純度98．2%。乳酸脫氫酶（LDH）、酸性磷酸酶（ACP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、α-糖苷酶（α-glucosidase）活力及唾液酸（SA）、果糖（Fructose）試劑盒，由南京建成生物工程有限公司提供。其余試劑為分析純。

1．1．3 主要儀器 血糖測定儀及試紙（美國強生公司）；紫外分光光度計、離心機（鞏義市英峪予華儀器廠）、104型電子天平（Made by Mettler-Toledo Group）、WB22型恒溫水浴箱（Made in German）。

1．2 方法

1．2．1 糖尿病大鼠模型的建立 雄性大鼠84只，分籠飼養(yǎng)。禁食不禁水12 h后，腹腔注射給予STZ 60 mg／kg造成糖尿病模型［5］，STZ以 pH 4．5的檸檬酸緩沖液溶解，即配即用。72 h后取尾靜脈血測血糖，血糖＞16．7 mmol／L者為糖尿病大鼠模型。正常組腹腔注射給予其它組相同體積的檸檬酸緩沖液。大鼠隨機分為6組（n＝14）：正常組、模型組、淫羊藿苷低、中、高劑量組和羅格列酮組。造模4周后，開始灌胃，淫羊藿苷、羅格列酮均以0．5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配成相應(yīng)的混懸液。淫羊藿苷低、中、高劑量組組分別灌胃給予 20、40及 80 mg／kg，羅格列酮組給予羅格列酮3 mg／kg，正常組與模型組給予相同體積的0．5%CMC-Na，每天給藥一次，連續(xù)8周。

1．2．2 血清葡萄糖測定 末次給藥后，空腹12 h，尾靜脈取血，用強生血糖儀測定各組血糖。

1．2．3 生化指標檢測 取右側(cè)附睪組織以冷生理鹽水在冰浴條件下制成10%勻漿液，離心（3 000 r／min，10 min），取上清液，-20℃保存。按試劑盒說明書方法檢測 LDH、ACP、γ-GT、α-糖苷酶活性及 SA、果糖含量。

1．2．4 組織學(xué)檢測 左側(cè)附睪組織以4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋切片，H-E染色，光鏡下觀察。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 淫羊藿苷對STZ致糖尿病大鼠血清葡萄糖的影響

模型組血糖比正常組明顯升高（P＜0．01），淫羊藿苷各劑量組血糖略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。羅格列酮組血糖明顯下降（P＜0．01，表1）。

Tab．1 Changes of serum glucose level（±s）

Tab．1 Changes of serum glucose level（±s）

**P＜0．01 vs control；＃＃P＜0．01 vs model

GCMIIIR roup Dose（mg／kg） n Glucose（mmol／L）ontrol － 14 5．6±1．2 odel － 11 20．4±2．8**cariin 20 12 18．6±4．2 cariin 40 12 18．3±3．6 cariin 80 13 17．8±4．9 osiglitazone 3 13 9．6±1．8＃＃

2．2 淫羊藿苷對附睪內(nèi)γ-GT、LDH、ACP及α-Glucosidase活性的影響

糖尿病模型組大鼠比正常組附睪中γ-GT活力明顯下降 44．6%，LDH下降 34．4%，ACP下降27．8%，α-糖苷酶下降 26．3%（P＜0．05，P＜0．01）。淫羊藿苷低劑量組γ-GT、LDH、ACP及α-糖苷酶活力比模型組略有提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。淫羊藿苷中劑量組比模型組γ-GT活力提高14．6%，LDH提高 11．4%、ACP提高 13．2%，α-糖苷酶提高13．7%；淫羊藿苷高劑量組γ-GT活力比模型組提高 24．7%，LDH提高 14．2%、ACP提高24．7%，α-糖苷酶提高 19．6%（P＜0．05，P＜0．01），羅格列酮組與模型組比，γ-GT活力提高 28．7%，ACP提高28．0%（P＜0．01），LDH和α-糖苷酶活力有所提高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05，表 2）。

Tab．2 Changes ofγ-GT、LDH、ACPandα-glucosidase activity in epididymis（x±s）

Tab．2 Changes ofγ-GT、LDH、ACPandα-glucosidase activity in epididymis（x±s）

γ-GT：γ-glutamyltranspeptidase；LDH：Lactate dehydrogenase；ACP：Acid phosphatase*P＜0．05，**P＜0．01 vs control；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01 vs model

Group Dose（mg／kg） n γ-GT（U／g pro）LDH（U／g pro）ACP（U／g pro）α-glucosidase（U／mg pro ）Control － 14 5082．6±343．1 1256．7±132．8 598．6±86．2 98．2±12．4 Model － 11 2816．1±323．5** 824．4±86．5** 432．3±113．6* 72．4±11．3**Icariin 20 12 2882．4±478．3 872．2±97．1 456．9±65．8 74．9±10．8 Icariin 40 12 3226．8±415．2＃ 918．3±87．9＃ 489．2±76．2＃ 82．3±8．7＃Icariin 80 13 3513．2±437．4＃＃ 941．2±106．7＃＃ 539．1±82．5＃＃ 86．6±9．6＃＃Rosiglitazone 3 13 3624．8±387．2＃＃ 885．3±92．8 553．5±57．2＃＃75．6±12．8

2．3 淫羊藿苷對附睪中唾液酸（SA）及果糖（Fructose）含量的影響

糖尿病模型組大鼠附睪中唾液酸和果糖的含量明顯下降（P＜0．05）。淫羊藿苷各劑量組唾液酸含量與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。淫羊藿苷中、高劑量組中果糖含量比模型組明顯升高（P＜0．05），低劑量組略有升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。羅格列酮組果糖含量與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），但唾液酸含量比模型組明顯升高（P＜0．05，表 3）。

Tab．3 Changes of SA and Fructose level in the epididymis（x±s）

Tab．3 Changes of SA and Fructose level in the epididymis（x±s）

SA：Sialic acid*P＜0．05 vs control；＃P＜0．05 vs model

Group Dose（mg／kg） n SA（mg／g pro）Fructose（mg／g pro ）59．4±9．6 Control － 14 51．2±11．3 87．2±13．4 Model － 11 32．4±4．3*56．5±11．2*Icariin 20 12 34．8±3．6 58．2±14．8 Icariin 40 12 35．3±4．2 65．1±12．6＃Icariin 80 13 35．7±3．9 67．9±10．8＃Rosiglitazone 3 13 42．3±4．1＃

2．4 淫羊藿苷對附睪組織結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下可見，正常組大鼠附睪管較為飽滿，管中成熟的絲狀精子豐富。糖尿病模型組附睪管多處呈空泡，管中成熟精子極少，可見多數(shù)未成熟精子聚集成團狀。淫羊藿苷低劑量組附睪管中精子數(shù)增加，但多為未成熟的精子聚集體，另有少量絲狀的成熟精子。淫羊藿苷中劑量組團狀的未成熟精子數(shù)目較少，有一定量的絲狀精子。淫羊藿苷高劑量組絲狀精子多見，亦有極少量團狀的未成熟精子，精子數(shù)相對于中劑量組較多。羅格列酮組附睪中有一定的絲狀精子及少量的團狀的未成熟精子聚集體（圖1）。

Fig．1 Histopathology of epididymis tissue in each group（HE×200）A：Control group；B：Model group；C：Icariin group（20 mg／kg）；D：Icariin group（40 mg／kg）；E：Icariin group（80 mg／kg）；F：Rosiglitazone group（3 mg／kg）

3 討論

糖尿病導(dǎo)致雄性生殖功能的變化已有諸多文獻報道，但多集中于睪丸病變及性功能方面，對于附睪的影響報道較少。有證據(jù)表明，附睪是精子成熟和獲能的重要場所［6］。附睪中的標志酶類主要是LDH、γ-GT、ACP及α-糖苷酶。其中 LDH促進能量代謝，是睪丸和附睪中共有的標志酶［7］。ACP和γ-GT則是為精子提供酸性的微環(huán)境。特別是γ-GT的活力在附睪中超出睪丸中幾十倍甚至上百倍，是精子成熟所必需的重要酶類［8］。精子在附睪中的主要能量來源為果糖，而與此相關(guān)的酶類為α-糖苷酶［9］。二者主要是為精子獲能提供重要的能量保障。精子成熟的標志之一是獲得運動能力。唾液酸是精子表面的一種糖蛋白，主要是起到免疫識別作用，且由于其帶負電荷，可使精子彼此分開而不致于聚集、粘結(jié)［10］。

本實驗選擇降血糖藥羅格列酮為陽性藥物。羅格列酮處理組附睪中γ-GT、ACP的活性升高，高于淫羊藿苷高劑量組，附睪中唾液酸亦有明顯的提高，但對于α-糖苷酶的活力及果糖含量影響無統(tǒng)計學(xué)差異。淫羊藿苷處理組中、高劑量組附睪中LDH、γ-GT、ACP、α-糖苷酶的活力及果糖含量提高。唾液酸略有提高，血糖略有下降，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。淫羊藿苷低劑量組作用不顯著。從本實驗結(jié)果來看，降低血糖不一定能全面改善附睪功能，其主要影響的標志酶或相關(guān)物質(zhì)是γ-GT、ACP及唾液酸，上述兩種酶均是維護附睪酸性微環(huán)境的酶類，而唾液酸則是在酸性環(huán)境下保持精子免疫識別功能的糖蛋白。羅格列酮對附睪能量代謝影響不顯著，可能是因為附睪中能量來源為果糖，而不是葡萄糖所致。淫羊藿苷主要各標志酶有明顯的作用，但對于唾液酸影響不明顯。可能是因為調(diào)控唾液酸的分泌的影響因素較多的緣故。從病理結(jié)果來看，羅格列酮處理組附睪中成熟精子相對較少，介于淫羊藿苷低、中劑量組之間。淫羊藿苷高劑量組對于病理的改善作用明顯。

從上述結(jié)果看來，淫羊藿苷能提高糖尿病大鼠附睪中標志酶的活力，可能主要是改善了附睪中的能量代謝而發(fā)揮作用。

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