銀屑病患者皮損間充質(zhì)干細(xì)胞對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

劉瑞風(fēng)，王 芳，楊元文，張開明(太原市中心醫(yī)院皮膚科，太原 030009;通訊作者，E-mail:zhangkaiming@sina.com)

銀屑病是一種以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖以及分化異常為特征的炎癥性皮膚病。皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞(skin-derived mesenchymal stem cells，S-MSCs)為皮膚微環(huán)境的重要組成成分之一，它不但參與皮膚組織的發(fā)育和再生;而且可以通過分泌細(xì)胞因子對皮膚微環(huán)境產(chǎn)生重要影響［1］。表皮細(xì)胞異常增殖是銀屑病的主要病理特點之一，研究銀屑病患者皮損MSCs生物學(xué)特性可以確切地反映銀屑病的實際發(fā)病狀況，我們設(shè)想銀屑病患者皮損MSCs對局部角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)可能有影響，故我們在體外將銀屑病患者皮損MSCs與人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察前者對后者增殖的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象與材料

1.1.1 研究對象 銀屑病患者8例，均為太原市中心醫(yī)院皮膚科臨床及病理確診為尋常性銀屑病的門診患者，就診前3個月內(nèi)局部及全身未使用過皮質(zhì)類固醇激素、維甲酸類藥物和免疫抑制劑。其中進(jìn)行期4例，靜止期4例，年齡14-56歲，平均(36.56±12.89)歲，病程10 d-20年。所有患者均依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評分進(jìn)行評估，PASI評分范圍在1.6-18.0，平均11.64。對照組8例，取自我院泌尿外科和整形科手術(shù)切除皮膚，性別、年齡與患者組匹配，均無銀屑病家族史，且入選禁用藥條件同患者組。取材均經(jīng)患者同意，并簽署知情同意書。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。本課題經(jīng)太原市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔培養(yǎng)板及Transwell小室購自美國Corning公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，Dispase酶Ⅱ、胰蛋白酶、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自美國Sigma公司，B27添加劑購自美國Gibco公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人 CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD34，CD45 及HLA-DR單克隆抗體購自美國貝克曼庫爾特公司，CountessTM自動細(xì)胞計數(shù)儀購自美國Invitrogen公司，iCELLigence實時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀購自美國艾森生物科學(xué)公司，IMT2型倒置相差顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;EPICS-XL型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 S-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下將標(biāo)本制成1 mm3大小的組織塊，0.25%Dispase酶Ⅱ37℃消化2-4 h，機(jī)械分離表、真皮，收集真皮部分，盡量切碎真皮組織，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吸管反復(fù)吹打組織使細(xì)胞分離，通過孔徑40 μm的篩網(wǎng)過濾，濾過液于冰上靜置20-30 min，離心棄上清，加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。培養(yǎng)條件為:DMEM/F12培養(yǎng)基，加入5%胎牛血清、bFGF 10 ng/ml、B27 添加劑 10 μl/ml及青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml，以 1 ×105個/cm2密度接種于T25塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。72 h后，全量換液棄去懸浮細(xì)胞，加入新配制的上述培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以后每3 d半量換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，細(xì)胞生長近90%融合狀態(tài)時用0.25%的胰酶消化傳代。細(xì)胞傳至第5代，用胰酶消化，收獲細(xì)胞，用PBS洗滌后計數(shù)，分別取2×105個細(xì)胞與FITC 標(biāo)記的小鼠抗人 CD29，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105和 HLA-DR單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30min，用PBS洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，對S-MSCs進(jìn)行鑒定。

1.2.2 實時動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)法進(jìn)行HaCaT細(xì)胞增殖檢測 向E-Plate檢測板中加入培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，以3×104細(xì)胞/孔接種于E-Plate L8檢測板(共3孔)，將1例患者和1例對照來源的第5代S-MSCs分別以3×105細(xì)胞/孔接種于E-Plate Insert上室(各1孔，孔徑0.4 μm)，并設(shè)HaCaT細(xì)胞自然增殖孔(1孔，上室不加S-MSCs)，室溫超凈臺內(nèi)放置30 min，將加入細(xì)胞的E-Plate檢測板放入檢測臺上，于37℃，5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行實時動態(tài)的細(xì)胞增殖檢測，分析細(xì)胞增殖曲線，并確定觀察增殖的最佳時間。

1.2.3 細(xì)胞計數(shù)法檢測HaCaT細(xì)胞的數(shù)量 取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，以1×105細(xì)胞/孔接種于24孔Transwell培養(yǎng)板(孔徑0.4 μm)下室，將患者或?qū)φ諄碓?各8例)的第5代S-MSCs以1×106細(xì)胞/孔接種于上室，并設(shè)HaCaT細(xì)胞自然增殖孔(不含S-MSC)8孔(每份標(biāo)本設(shè)兩個復(fù)孔，最后取其平均值)，于37℃，5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，74 h(依據(jù)方法2確定的觀察增殖最佳時間)后將上室連同S-MSCs取出，胰酶消化并收獲下室HaCaT細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示。S-MSCs對HaCaT細(xì)胞增殖的影響采用方差分析，患者組和對照組HaCaT細(xì)胞數(shù)量比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者和正常對照S-MSCs的形態(tài)特點及流式鑒定結(jié)果

倒置相差顯微鏡下觀察，銀屑病患者組和對照組分離的S-MSCs形態(tài)相似。原代細(xì)胞接種72 h后，可見少量貼壁細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞明顯增大并且分裂增殖，基本上為梭形成纖維細(xì)胞狀形態(tài)，細(xì)胞互相重疊呈復(fù)層生長(圖1A，B，見第917頁)。患者組和對照組細(xì)胞原代培養(yǎng)時間相似，平均為(25.10±7.38)d，細(xì)胞達(dá)90%融合狀態(tài)(圖1C，見第917頁)。傳代細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后變形，呈圓形，經(jīng)24 h后恢復(fù)原來形態(tài)，并貼壁增殖，形態(tài)和原代細(xì)胞相似，3-4 d后呈融合狀態(tài)。

2.2 銀屑病患者和對照S-MSCs的表型鑒定結(jié)果

兩組細(xì)胞傳5代后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果均顯示S-MSCs表面抗原高表達(dá) CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，而 CD34、CD45 及 HLA-DR 表達(dá)陰性(見圖2)。說明分離、培養(yǎng)后獲得的細(xì)胞符合SMSCs的特點。

圖1 S-MSCs在倒置相差顯微鏡下的形態(tài)特點 (×200)Figure 1 Morphological characteristics of S-MSCs under an inverted phase-contrast microscope

圖2 S-MSCs的表型鑒定Figure 2 Phenotype identification of S-MSCs

圖3 HaCaT細(xì)胞增殖曲線Figure 3 HaCaT cell proliferation curves

2.3 實時動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)法檢測結(jié)果

與HaCaT細(xì)胞自然增殖相比，與S-MSCs共培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞增殖能力減弱，表明銀屑病患者及對照S-MSCs均可抑制HaCaT細(xì)胞增殖(自然增殖HaCaT細(xì)胞 CIMax值為 4.95，患者組 HaCaT細(xì)胞CIMax值為 3.88，對照組 HaCaT細(xì)胞 CIMax值為3.11)，但與對照S-MSCs相比，患者皮損MSCs的抑制能力較弱(圖3，見第917頁)。從圖中還可得知，培養(yǎng)72-75 h后，三組細(xì)胞陸續(xù)達(dá)到最大增殖狀態(tài)，因此，在72-75 h之間均可作為細(xì)胞增殖的觀察點。

2.4 HaCaT細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

銀屑病患者及對照S-MSCs與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞計數(shù)法檢測結(jié)果顯示，與自然增殖組相比，與S-MSCs共培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的增殖能力顯著降低，表明銀屑病患者皮損及正常皮膚來源的MSCs對HaCaT細(xì)胞增殖均有抑制作用(P＜0.05)，但患者皮損MSCs的抑制能力減弱［患者組HaCaT細(xì)胞計數(shù)結(jié)果為(2.35±0.254)×105，對照組HaCaT細(xì)胞計數(shù)結(jié)果為(2.04±0.122)×105，P ＜0.05，見表1］。

表1 銀屑病患者皮損和對照S-MSCs與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)及HaCaT細(xì)胞自然增殖組細(xì)胞計數(shù)檢測結(jié)果比較(±s)Table 1 HaCaT cell counts in natural proliferation group，co-cultured with patient S-MSCs group，and cocultured with control S-MSCs group(±s)

表1 銀屑病患者皮損和對照S-MSCs與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)及HaCaT細(xì)胞自然增殖組細(xì)胞計數(shù)檢測結(jié)果比較(±s)Table 1 HaCaT cell counts in natural proliferation group，co-cultured with patient S-MSCs group，and cocultured with control S-MSCs group(±s)

與HaCaT細(xì)胞自然增殖組比較，*P＜0.05;與對照SMSCs共培養(yǎng)組比較，#P＜0.05

組別 n 細(xì)胞計數(shù)/×105 HaCaT細(xì)胞自然增殖組8 2.76±0.216與對照S-MSCs共培養(yǎng)組 8 2.04±0.122*與患者S-MSCs共培養(yǎng)組 8 2.35±0.254*#

3 討論

角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)是人皮膚表皮的主要細(xì)胞，具有強(qiáng)烈的增殖和分化能力，是皮膚更新、屏障和免疫的主要功能性細(xì)胞之一。基底層細(xì)胞不斷分裂、增生，并隨著衰老向上推移，經(jīng)過棘細(xì)胞層，達(dá)到顆粒層最外層最終演變成角質(zhì)層細(xì)胞。在皮膚中，機(jī)體通過調(diào)節(jié)KC的增殖，調(diào)控表皮生長分化，保持表皮層的穩(wěn)定。HaCaT細(xì)胞來源于成人表皮細(xì)胞，本研究結(jié)果顯示，S-MSCs可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，這一機(jī)制對于保持KC的自然生長平衡、維持表皮層的穩(wěn)定起著非常重要的作用。

KC增殖、分化、凋亡(角質(zhì)層形成)的過程，使細(xì)胞逐漸分化、成熟，逐漸走向死亡的過程，是受許多相互制約的調(diào)控機(jī)制精細(xì)控制的，當(dāng)其中任何一環(huán)產(chǎn)生異常時，KC的分化進(jìn)程就會受到影響，進(jìn)而產(chǎn)生復(fù)雜的病理生理反應(yīng)，從而導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生發(fā)展。KC分化異常在幾種皮膚疾病，特別是銀屑病的發(fā)病中起著重要作用［2］。銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，然而KC的過度增殖是該病重要的病理特征之一［3］。Wrone-Smith 等［4］發(fā)現(xiàn)銀屑病中bcl-X1基因在增生的KC上呈強(qiáng)陽性表達(dá)，認(rèn)為bcl-X1基因可能通過抑制表皮細(xì)胞凋亡，從而延長細(xì)胞的存活期，導(dǎo)致表皮增生。本研究結(jié)果顯示，銀屑病患者KC異常增殖與皮損MSCs密切相關(guān)，患者皮損MSCs抑制KC增殖的能力減弱，這可能是KC增殖異常的原因之一。對于皮損MSCs導(dǎo)致KC增殖異常的具體作用機(jī)制將是本研究之系列研究的重要內(nèi)容。

本研究采用iCELLigence RTCA實時監(jiān)測HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)以反映細(xì)胞的生長情況，來研究S-MSCs對HaCaT細(xì)胞生長的影響。通過考察不同培養(yǎng)條件下HaCaT細(xì)胞的生長曲線，選擇了74 h作為后期實驗細(xì)胞增殖的觀察點。RTCA技術(shù)對細(xì)胞的監(jiān)測是實時、動態(tài)進(jìn)行的，此方法可以與傳統(tǒng)終點實驗聯(lián)合使用，以定義實驗中的治療或干預(yù)的終點時間，獲得的信息可以幫助研究者了解目前的終點實驗所無法得知的中間數(shù)據(jù)［5］。本研究結(jié)果證實了我們開始的設(shè)想，即銀屑病患者皮損MSCs有異常，其對KC增殖的抑制能力減弱，這導(dǎo)致KC在皮損局部的異常增殖，促進(jìn)了銀屑病皮損的發(fā)生和發(fā)展。

深入研究KC增殖調(diào)控通路及調(diào)控因子對于銀屑病的研究具有相當(dāng)重要的理論和實際意義，也為該類疾病的治療樹立一座嶄新的路標(biāo)。本研究為銀屑病的病因探討提供了新的思路，并為尋找治療銀屑病的新的藥物作用靶點和方法提供參考。

［1］ Salvolini E，Orciani M，Vignini A，et al.Skin-derived mesenchymal stem cells(S-MSCs)induce endothelial cell activation by paracrine mechanisms［J］.Exp Dermatol，2010，19(9):848-850.

［2］ Nagpal S，Thacher SM，Patel S，et al.Negative regulation of two hyperproliferative keratinocyte differentiation markers by a retinoic acid receptor-specific retinoid:insight into the mechanism of retinoid action in psoriasis［J］.Cell Growth Differ，1996，7(12):1783-1791.

［3］ Mckee PH，Calonje E，Granter SR.皮膚病理學(xué):與臨床的聯(lián)系［M］.朱學(xué)駿，孫建方，譯.3版.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007:195-206.

［4］ Wrone-Smith T，Johnson T，Nelson B，et al.Discordant expression of Bcl-x and Bcl-2 by keratinocytes in vitro and psoriatic keratinocytes in vivo［J］.Am J Pathol，1995，146(5):1079-1088.

［5］ Atienzar FA，Tilmant K，Gerets HH，et al.The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery:defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models［J］.J Biomol Screen，2011，16(6):575-587.