瘢痕疙瘩成纖維細胞中有關傳導分子mRNA水平的實驗研究

弓軍勝，馮瑞錚，余睿芳(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院整形科，太原 030001;通訊作者，E-mail:frz1121@sina.com)

瘢痕的形成與成纖維細胞內高表達轉化生長因子 β(transforming growth factor-beta，TGF-β)信號關系密切［1］。TGF-β/Smads信號通路異?；罨?，能有效地刺激瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、合成和分泌大量Ⅰ、Ⅲ型膠原，最后導致瘢痕的形成。TGF-β誘導早期基因(TGF-β inducible early gene，TIEG)能夠模擬 TGF-β/Smads信號通路的生物學效應，增強TGF-β/Smads的轉錄因子的調控作用，并且發(fā)現(xiàn)TIEG增強Smads信號通路的作用是通過上調Smad2基因轉錄，抑制Smad7啟動子附近特殊的反應元件實現(xiàn)的［2］。

本課題將通過對正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞體外培養(yǎng)的實驗研究，對其TGF-β/Smads信號傳導通路中有關傳導分子 mRNA(如 TIEG、Smad2、Smad7)的表達情況進行比較，并探討相關意義，為今后臨床應用提供一定的理論和實驗指導。

1 材料與方法

1.1 材料

瘢痕疙瘩標本取自我院就診治療的患者50例。無結締組織、心、肝、腎、肺等疾患，6個月內未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，且未曾接受放療。將標本漂洗數(shù)次，分別去除上皮，分別切成5塊2 mm×2 mm大小的組織塊，送入無菌培養(yǎng)瓶中，加入RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)瓶翻轉，另加5 ml培養(yǎng)液及少量胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。每3-4 d換液一次。待培養(yǎng)的成纖維細胞長滿瓶底后，PBS漂洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，繼續(xù)培養(yǎng)［3］。取第5代之內的細胞用于本實驗研究。

1.2 方法

1.2.1 細胞總RNA的提取 分別取瘢痕疙瘩與正常皮膚組織的細胞共100例，并將其按Tripure Reagent總RNA分離試劑盒說明進行提取RNA。

1.2.2 提取的總RNA的濃度、純度測定和完整性分析 用紫外分光光度儀分別測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度(OD260和OD280)，通過以下公式計算RNA的濃度:RNA(μg/μl)=OD260×40/1 000×稀釋倍數(shù)，同時計算 OD260和 OD280的比值(OD260/OD280)，當比值接近于2.0時，說明提取的RNA較純，可用于后續(xù)實驗，-70℃保存。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳進行完整性的鑒定。

1.2.3 RT-PCR 用總RNA制備cDNA:在2 5 μl反應體系中包括1 μg 待檢總 RNA，2 μl Oligo(dT)，5 μl AMV Buffer，5 μl 三 磷 酸 脫 氧 核 糖 核 苷(dNTP)，0.5 μl RNA 酶抑制物，l μl禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶，0.1%焦碳酸二乙酶(DEPC)水13.5 μl，42 ℃水浴1 h 后，5 ℃ 5 min 破壞反轉錄酶終止反應。冰浴5 min后-70℃保存。

PCR擴增β-actin以及各個目的基因:在50 μl反應體系中包括 2 μl cDNA，5 μl 10 ×Taq Buffer，上游引物、下游引物各 1 μl，4 μl 25 mmol/L MgCl2，8 μl dNTP 的混合物，濃度為 2.5 mmol/L，1 μl Ex Taq DNA 酶(5 U/μl)，28 μl去離子水。具體引物序列見表1。

表1 有關傳導分子引物序列Table 1 Sequencing of primers

PCR反應條件如下:94℃ 5 min預變性，隨后進行35個循環(huán)，94℃ 1 min變性，52-58℃ 1 min退火，72℃ 1 min延伸，最后72℃ 10 min充分延伸。反應結束后，取10 μl PCR產(chǎn)物電泳鑒定，以明確擴增產(chǎn)物的數(shù)目和大小。

1.2.4 電泳條帶的光密度計算和統(tǒng)計學分析 對各電泳條帶的光密度定量分析，RT-PCR產(chǎn)物以各組細胞的目的基因與β-actin的光密度比值進行比較，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，實驗結果進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

用Tripure提取成纖維細胞總RNA，用變性的甲醛電泳證實了所提取的總RNA的比值約為2∶1，圖1中可見其中6個樣本清晰的28 s、18 s和5 s三條帶，而且28 s與18 s的比值約為2∶1，表明提取的RNA結構完好，無降解。

圖1 成纖維細胞提取的RNA凝膠電泳圖(從左至右依次為6個樣本的電泳帶)Figure 1 Gel electrophoresis of extracted RNA in keloid fibroblasts

采用RT-PCR法，從成纖維細胞中擴增出了相應的目的基因cDNA片段。瘢痕疙瘩成纖維細胞組TIEG、Smad2 mRNA表達水平明顯高于正常皮膚成纖維細胞組，而Smad7 mRNA表達水平明顯低于正常皮膚成纖維細胞組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表2及圖2)。

表2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細胞中各基因mRNA表達水平 (n=100)Table 2 The mRNA levels of TIEG，Smad2，Smad7 in fibroblasts of keloid tissues and normal controls(n=100)

3 討論

創(chuàng)傷愈合時過度的組織纖維化導致瘢痕疙瘩形成，在此過程中TGF-β與受體的過度表達是一個關鍵的因素。TGF-β分泌活躍的細胞出現(xiàn)在傷口部位時，可以通過自分泌和旁分泌作用來加強其致纖維化的作用。

TGF-β/Smads信號通路中 TGF-β的生物學效應主要通過細胞內的 Smad蛋白介導［4］，其中受體調節(jié)性Smads(Smad2，Smad3)起著正性調節(jié)作用，促進瘢痕的形成，抑制性Smad(Smad7)發(fā)揮負反饋調節(jié)作用［5］，抑制瘢痕的進展。而TGF-β致纖維化的效應主要是通過促進細胞外基質(ECM)合成，抑制ECM降解，最終導致ECM的積聚。

圖2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組成纖維細胞中各基因mRNA表達電泳圖Figure 2 The mRNA expression of TIEG，Smad2，Smad7 mRNA in fibroblasts of keloid tissues and normal controls by RTPCR

本研究顯示瘢痕疙瘩成纖維細胞中，TIEG mRNA水平的表達遠高于正常皮膚成纖維細胞，可見TIEG以及TGF-β的過度表達與瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展有密切關系。進一步又分析了Smad蛋白的表達，顯示瘢痕疙瘩中表達Smad2 mRNA增強，表達Smad7 mRNA減弱，說明 TIEG能夠模擬 TGF-β/Smads信號通路的生物學效應并依賴于 Smad2，TIEG過度表達能下調內源性Smad7并上調Smad2基因轉錄。

最新研究表明細胞外基質主要成分的基因啟動子上存在Smads蛋白的結合位點［6］，一些參與細胞外基質調控如CTGF、α-SMA、Smad7等的基因啟動子上亦發(fā)現(xiàn)有 Smads蛋白的結合位點［25，26］。TGF-β可通過Smads信號蛋白調節(jié)上述靶基因的表達，參與組織纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

［1］ Meran，S;Thomas，DW:Stephens，P，et al.Hyaluronan facilitates transforming growth factor-beta(1)-mediated fibroblast proliferation［J］.J Biol Chem，2008，283:6530.

［2］ 楊娥，鄒崎葩，張恒術.DNA甲基轉移酶1在人瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及意義［J］.中華整形外科雜志，2013，29(2):117-120

［3］ Gordon，Kelly J;Blobe，Gerard C.Role of transforming growth factor be to superfamily signaling pathways in human disease［J］.Biochim Biophys Acta，2008，4(1978):197

［4］ 繆澤群，宋韜.TGF-β1調節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細胞分泌MMP-1及TIMP-1的研究［J］.中國麻風皮膚病雜志，2013，29(6):373-375.

［5］ 弓軍勝，蘭麗珍，孫遼.載體介導的siRNA抑制TIEG在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達［J］.中國藥物與臨床，2007，7(2):106-108.

［6］ 刁建升，馬顯杰.瘢痕疙瘩發(fā)病機制和藥物治療研究新進展［J］.中國美容整形外科雜志，2013，24(3):187-189.