槲皮素干預(yù)下HBx基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞侵襲、遷移、增殖的影響

成碧萍，蘇 杰，姚 楊，白跳艷，徐 銳(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710077;通訊作者，E-mail:yaoyang1220@sina.com)

流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究認(rèn)為，乙型肝炎病毒(HBV)是HBV相關(guān)性肝癌(HCC)發(fā)生的高危因素，HBx是HBV 4個(gè)開(kāi)放讀碼框架中X編碼的一種病毒多功能蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，X基因表達(dá)產(chǎn)物(HBx)在肝癌形成過(guò)程中參與肝癌血管生成［1］，可能通過(guò)多種復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，與HCC的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系［2，3］。因此，以 HBx作為肝癌基因治療靶點(diǎn)具有一定的臨床應(yīng)用前景。隨著對(duì)腫瘤治療研究不斷的深入，發(fā)現(xiàn)廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物有抗腫瘤的作用［4］。近年來(lái)研究［5］表明，槲皮素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物作用的敏感性。本文就槲皮素對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HBx基因的HepG2-X的侵襲、遷移及增殖的影響進(jìn)行了研究，進(jìn)一步探討槲皮素的功能及其可能機(jī)制，另外，本文研究HBx在槲皮素干預(yù)下對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，探討HBx致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌HepG2及HepG2-X細(xì)胞株由西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，槲皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解后-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋。MTT和DMSO購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存管，40℃水浴融化，1 500 r/min離心3 min后棄上清;沉淀物用RPMI1640完全培養(yǎng)液混懸后適量培養(yǎng)液稀釋，轉(zhuǎn)入無(wú)菌培養(yǎng)瓶;在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng);次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿70%-80%培養(yǎng)瓶時(shí)，用2.5 g/L的胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，滴管吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞，1∶4分瓶傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集，在收集前1 d換液1次，用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，離心，棄上清，加入凍存液，以1×106/ml的密度混懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至凍存管，標(biāo)記好后置于4℃冰箱30 min，轉(zhuǎn)至-20℃冰箱2-3 h，然后放入-80℃冰箱暫存，最后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。

1.3 MTT法觀察細(xì)胞增殖并測(cè)定槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)分為槲皮素處理組和DMSO對(duì)照組(含0.02%的DMSO)。將傳代的HepG2及HepG2-X細(xì)胞培養(yǎng)板中的原培養(yǎng)基吸出，分別加入溶于DMEM培養(yǎng)基中的槲皮素，其終濃度為0(空白對(duì)照組)，10，20，40，80 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl的二甲亞砜，振搖溶解結(jié)晶后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于595 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各孔吸光度(A)值，取其均數(shù)作為本次A值計(jì)數(shù)值。以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，同樣采用MTT法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)。IR=(對(duì)照組A值均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組A值均數(shù))/對(duì)照組A值均數(shù)×100% 。IR值越高，抑制作用越強(qiáng)。

1.4 細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)

Matrigel膠4℃過(guò)夜融化，與無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基按1∶1 比例稀釋，以 60 μl/孔在 Transwell上室進(jìn)行鋪膠，37℃放置于通風(fēng)櫥3 h使其成膠。經(jīng)10，20，40，80 μmol/L 濃度的槲皮素處理細(xì)胞，胰蛋白酶消化，使細(xì)胞懸浮，經(jīng)離心收集后用無(wú)血清RPMI1640 稀釋成5 ×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，下室加入500 μl含血清 RPMI1640培養(yǎng)液。常規(guī)條件下培養(yǎng)36 h，取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透微孔濾膜的上室細(xì)胞，PBS漂洗1次，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗2次，Giemsa染色30 min，雙蒸水沖洗。取下微孔濾膜，置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算基底膜下細(xì)胞，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)4次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的作用

MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞A值發(fā)現(xiàn)，HepG2-X細(xì)胞在24 h、48 h和72 h的A值均明顯高于HepG2細(xì)胞(P＜0.05，見(jiàn)圖1，2)，表明 HepG2-X 細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，顯示HBx對(duì)HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。各組中隨著槲皮素濃度的增加，所測(cè)得的A值逐漸降低，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，槲皮素處理組細(xì)胞增殖被明顯抑制，隨濃度的增加其抑制作用逐漸增強(qiáng)，槲皮素在濃度80 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖抑制最為明顯;不同濃度的槲皮素處理組作用后抑制率(IR)隨著時(shí)間的增加而升高，各組較前時(shí)間點(diǎn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1，2)，且抑制作用與時(shí)間及濃度呈明顯正相關(guān)。

圖1 不同濃度槲皮素對(duì)HepG2-X細(xì)胞增作用的影響Figure 1 The inhibitory effect of different concentrations of quercetin on HepG2-X cells proliferation

表1 槲皮素對(duì)HepG2-X細(xì)胞作用不同時(shí)間的A值及生長(zhǎng)抑制率Table 1 The absorbance and inhibitive rate of HepG2-X cells at different time after quercetin treatment

表2 槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞作用不同時(shí)間的A值及生長(zhǎng)抑制率Table 2 The absorbance and inhibitive rate of HepG2cells at different time after quercetin treatment

2.2 槲皮素可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移的抑制

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，槲皮素處理36 h后，其侵襲能力明顯減弱，與對(duì)照組遷移率100%相比，10，20，40，80 μmol/L 槲皮素處理組與空白對(duì)照組相比穿過(guò)濾膜的HepG2細(xì)胞明顯減少，遷移細(xì)胞比率分別為91.82%，67.72%，48.20%，27.80%(P＜0.05);各處理組中不同濃度槲皮素作用后穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)量隨槲皮素濃度增加而減少。

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，廣泛分布于植物、食物及中草藥之中。據(jù)報(bào)道，黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［6］。我國(guó)每年約有11-13萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌，占全球肝癌死亡數(shù)的半數(shù)之多。在誘發(fā)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的眾多因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染占到 50% 以上［7］。因此迫切需要尋找一種有效的臨床治療方法。槲皮素為黃酮類的一種，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能有效抑制結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌以及乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［8-12］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討槲皮素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的影響，及HBx干預(yù)下對(duì)其影響，旨在為槲皮素應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供依據(jù)，以及將HBx作為肝癌基因治療提供理論基礎(chǔ)［13，14］。

圖3 槲皮素對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的抑制Figure 3 Inhibitive effect of quercetin on the invasion of HepG2cells

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell侵襲小室模型在體外進(jìn)行腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)，觀察到HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，加入槲皮素后，其侵襲能力明顯減弱，呈濃度依賴性，說(shuō)明槲皮素可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。此外采用 MTT檢測(cè) HepG2-X細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖情況表明，槲皮素對(duì)兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性具有抑制作用，其增殖抑制率與作用時(shí)間和劑量呈明顯的相關(guān)性，隨藥物濃度增大作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率明顯升高。以上結(jié)果表明，HBx可能促進(jìn)肝細(xì)胞癌變或增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，槲皮素能夠抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖及侵襲力，作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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