反芻動(dòng)物Ghrelin研究進(jìn)展

劉 璐，夏利寧，姚 剛，趙紅瓊

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

Ghrelin的發(fā)現(xiàn)之旅源于人們觀察到嗎啡具有促進(jìn)生長激素（growth hormone，GH）分泌的作用，進(jìn)而在動(dòng)物體中分離到了腦啡肽類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)合成了一系列腦啡肽類似物，它們具有選擇性促進(jìn)GH 分泌的作用，這些類似物被稱為促生長激素釋放物（GH-secretagogue，GHS）［1］。1996年，美國科學(xué)家Howard等在人和豬的下丘腦、垂體、腹內(nèi)側(cè)核和漏斗核發(fā)現(xiàn)并克隆出了一種G 蛋白偶聯(lián)受體，并且證明了它是其中一種合成的促生長激素釋放物MK-0677作用的受體，因而該受體被命名為生長激素促泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHS-R），但其內(nèi)源性配體尚不清楚。此后很多相關(guān)研究小組開始尋找這個(gè)受體的內(nèi)源性配體。1999年，日本科學(xué)家Kojima利用能夠穩(wěn)定表達(dá)GHS-R 的細(xì)胞株，從大鼠胃中首先提純出含28個(gè)氨基酸的活性多肽。該多肽可以激活GHS-R 并刺激GH 的分泌。這種GHS-R 的內(nèi)源性配體被命名為Ghrelin?！癵hre”在原始印歐語中具有“生長”的意思，“gh”是生長激素的縮寫，“rel”可以看做“release（釋放）”的一部分［2］，因此用Ghrelin來命名一個(gè)具有促進(jìn)生長激素釋放活性的多肽是相當(dāng)貼切的。由于Ghrelin的發(fā)現(xiàn)只有十幾年，我國學(xué)術(shù)界對Ghrelin的翻譯也不統(tǒng)一，主要有“生長激素釋放肽”、“生長素”、“胃促生長素”、“胃饑餓素”和“促生長激素釋放激素受體配體”等。由于Ghrelin的中文翻譯的不統(tǒng)一，故而我國很多研究人員在論文中直接使用其英文名稱。

Ghrelin多肽N-端第3位的絲氨酸殘基被疏水的n-辛?；揎?，這對于維持Ghrelin 的活性是必需的，這種被修飾的Ghrelin 被稱為?；疓hrelin。目前已發(fā)現(xiàn)的Ghrelin 受體有GHS-R 1a 和GHS-R 1b 兩 種 型。GHS-R 1a為Ghrelin的功能性受體，Ghrelin 的促GH 釋放效應(yīng)主要是通過與GHS-R 1a結(jié)合而發(fā)揮的，而GHS-R1b目前未發(fā)現(xiàn)其藥理學(xué)活性。用放射免疫法（RIA）測定表明，荷斯坦牛6月齡母牛血漿總Ghrelin（包括?；疓hrelin、非酰基化Ghrelin和Ghrelin的C-端殘基）的生理水平2.8ng／mL±0.7ng／mL是?；疓hrelin生理 水平195.1pg／mL±33.7pg／mL 的16倍［3］。根據(jù)Uniprot中Ghrelin序列比較，顯示Ghrelin N-端的10個(gè)氨基酸序列在哺乳動(dòng)物呈高度保守，證明其N-端氨基酸序列在執(zhí)行生物學(xué)功能方面的重要性。牛和羊Ghrelin為27個(gè)氨基酸的形式，只有17位的1個(gè)氨基酸不同（羊?yàn)楦彼?，牛為精氨酸）?/p>

1 反芻動(dòng)物Ghrelin的組織分布

探查反芻動(dòng)物Ghrelin 的組織分布，有利于了解分泌Ghrelin的主要組織，為探究機(jī)體是如何調(diào)控Ghrelin打下基礎(chǔ)。Ghrelin免疫活性細(xì)胞廣泛的分布于牛、綿羊和馬的頸部到胃底泌酸腺。對Kazak公綿羊的下丘腦、垂體、心臟、肝臟、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、十二指腸和背最長肌進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)有Ghrelin mRNA 的分布，其中在皺胃中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織［4］。在奶牛乳清和乳中均檢測到?；头酋；疓hrelin的存在［5］。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí)Ghrelin 基因在烏珠穆沁羊子宮體、輸卵管、子宮頸和陰道組織內(nèi)均有表達(dá)且表達(dá)量不同，子宮體表達(dá)量最高，輸卵管次之，子宮頸和陰道內(nèi)的表達(dá)量最少［6］。在羊卵母細(xì)胞檢測到了Ghrelin 和GHS-R1a的mRNA 及其蛋白質(zhì)的存在［7］。在內(nèi)蒙古羊卵泡中也檢測到了Ghrelin mRNA 及其多肽的存在，并且發(fā)現(xiàn)不同周期Ghrelin mRNA 的表達(dá)量也不同，在黃體生成期最高，而消退期最低［6］。Ghrelin／GHS-R 系統(tǒng)在生殖系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)從組織學(xué)角度提示Ghrelin可能與反芻動(dòng)物生殖周期的調(diào)節(jié)和妊娠有重要關(guān)系。

2 Ghrelin對反芻動(dòng)物的生物學(xué)作用

2.1 對生長激素分泌的調(diào)控

在反芻動(dòng)物體內(nèi)外試驗(yàn)均證明，Ghrelin不論是靜脈注射、動(dòng)脈注射、腦內(nèi)注射，還是在離體試驗(yàn)中，均能夠促進(jìn)生長激素（GH）的釋放，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，該作用比下丘腦生長激素釋放素（GHRH）的作用弱。但是3μ／kg體重rGhrelin對GH的釋放作用弱于2.5μ／kg體重鼠GHRH［9］，提示Ghrelin雖然可以促進(jìn)GH 的分泌，但是其作用效果弱于GHRH。ThidarMyint等研究表明靜脈一次性分別注射bGhrelin和人GHRH（hGHRH）在斷奶前后犢牛均能夠升高血漿GH 水平，然而將bGhrelin和hGHRH 同時(shí)注射，在斷奶前顯示出了協(xié)同升高GH 水平，但是在斷奶后這種協(xié)同作用未檢測到［10］。莎能奶山羊靜脈 注射Ghrelin（3.0 μg／kg），3h 后 宰 殺，檢 測 發(fā)現(xiàn)下丘腦中GHRH mRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)［11］。但在小公牛下丘腦基底部弓狀核輸注10nmol的rGhrelin 顯著地促進(jìn)GH 釋放（P＜0.05），并且在輸注后10min檢測到峰值，在1h后降低至正常水平［9］。這些研究結(jié)果說明，Ghrelin 可能是通過GHRH 途徑調(diào)節(jié)垂體GH 釋放，也可能間接地通過下丘腦來完成這種作用。

Ghrelin分子存在兩種形式，即酰基化Ghrelin和去?；疓hrelin。?；疓hrelin能夠促進(jìn)綿羊GH 的分泌，調(diào)節(jié)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素等激素的分泌［12］。在靜脈注射酰基化bGhrelin（1.0 U／kg體重）之前5 min 注射非?；痓Ghrelin（10.0 μg／kg體重），并未影響?；疓hrelin的促GH 和胰島素釋放作用［13］，提示非?；疓hrelin可能不是酰基化Ghrelin在調(diào)控內(nèi)分泌作用中的頡頏劑。

2.2 促進(jìn)食欲、調(diào)節(jié)能量平衡

在單胃動(dòng)物研究普遍認(rèn)為Ghrelin可能通過胃腸道、下丘腦和垂體來調(diào)節(jié)食欲和能量平衡，是一種能夠促進(jìn)食欲的激素。對定期飼喂的Suffolk母羊進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在即將飼喂前Ghrelin 水平短暫激增，餐后幾分鐘內(nèi)Ghrelin水平又迅速降低［14］，該結(jié)果表明反芻動(dòng)物饑餓時(shí)Ghrelin 水平升高，可能和增加食欲有關(guān)。給未成熟母綿羊腦室輸注Ghrelin可增加下丘腦神經(jīng)肽Y（NPY）mRNA 表達(dá)及其多肽免疫活性物質(zhì)量［15］。由于神經(jīng)肽Y 被經(jīng)典地歸于能夠促進(jìn)食欲的激素，因此Ghrelin和神經(jīng)肽Y在調(diào)節(jié)食欲方面可能存在相互的間接調(diào)控作用。然而，在4周齡代乳料飼喂羔羊餐后盡管血漿GH 改變，但是Ghrelin水平?jīng)]有變化，在13 周齡苜蓿顆粒飼料飼喂羔羊餐后血漿GH 和Ghrelin水平均沒有變化［16］，該研究結(jié)果對在羊Ghrelin是否具有調(diào)控食欲提出了質(zhì)疑。在此值得一提的是我們曾經(jīng)給饑餓24h后的8頭7月齡荷斯坦公牛飼喂常規(guī)精料，用放射免疫法測定血漿Ghrelin水平，并沒有發(fā)現(xiàn)在飼喂前后Ghrelin 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（該結(jié)果未發(fā)表），因此，我們認(rèn)為在反芻動(dòng)物Ghrelin水平是否真的具有調(diào)控食欲的功能值得進(jìn)一步探討。在禁食公牛靜脈注射bGhrelins可升高血漿GH 水平但不影響血漿胰島素、血糖和游離脂肪酸（NEFA）水平［17］。去勢Suffolk公羊在禁食和飼喂?fàn)顟B(tài)下，Ghrelin對葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌分別具有抑制和促進(jìn)作用［18］。公羊在飼喂后3h 靜脈輸注羊Ghrelin可增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌［12］。這些結(jié)果提示Ghrelin可能參與調(diào)控機(jī)體的能量代謝，也存在通過對食欲的調(diào)節(jié)來發(fā)揮對能量平衡的調(diào)節(jié)作用。

2.3 對生殖和泌乳的調(diào)控

我國研究人員對反芻動(dòng)物Ghrelin功能的研究相對較少，主要集中在其對反芻動(dòng)物生殖功能的影響。杜晨光等［19］報(bào)道綿羊發(fā)情期黃體細(xì)胞的Ghrelin免疫活性遠(yuǎn)強(qiáng)于其前身壁顆粒細(xì)胞，而且Ghrelin mRNA 相對表達(dá)量也顯著高于其前身壁顆粒細(xì)胞，表明Ghrelin對于黃體功能具有潛在調(diào)控作用。Ghrelin基因或其多肽在反芻動(dòng)物生殖系統(tǒng)均被檢測到［6］，表明Ghrelin可能與生殖周期和妊娠的調(diào)節(jié)有重要關(guān)系。在哺乳期的薩能奶山羊（40.6kg±2.8kg）乳腺組織中，能夠穩(wěn)定的檢測到Ghrelin和GHSR-1a的mRNA，并且Ghrelin、GHS-R1a和β-酪蛋白的表達(dá)模式非常相似，在哺乳期中產(chǎn)奶量最高時(shí)（60d～120d）表達(dá)量最高，在產(chǎn)奶量最低時(shí)（180d）表達(dá)量最低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Ghrelin在培養(yǎng)的乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞能夠劑量依賴性的促進(jìn)β-酪蛋白的表達(dá)，并且能夠被D-Lys3-GHRP6控制［20］，這說明Ghrelin可能具有通過GHSR-1a調(diào)控反芻動(dòng)物乳腺的功能。

3 反芻動(dòng)物Ghrelin分泌的調(diào)節(jié)

3.1 攝食對Ghrelin分泌的調(diào)節(jié)

Ghrelin的發(fā)現(xiàn)和研究在學(xué)術(shù)界被重視，其重要的一個(gè)原因是發(fā)現(xiàn)在單胃動(dòng)物攝食可影響Ghrelin水平，進(jìn)而其被歸類到調(diào)節(jié)食欲激素范疇，那么在反芻動(dòng)物研究結(jié)果如何？Sheahan A J等［21］報(bào)道飼喂后多胎奶牛Ghrelin水平下降。在成年的奶牛，血漿Ghrelin 濃度在飼喂后下降，但是這種下降在3月齡的小母牛不明顯［22］。同樣，在斷奶前后荷斯坦小公牛餐后Ghrelin水平下降，注射揮發(fā)性脂肪酸顯著降低循環(huán)Ghrelin水平［23］。在公牛飼喂前血漿Ghrelin水平高于飼喂后，而且禁食組血漿Ghrelin水平明顯高于飼喂組［17］。公牛在生長期給予高能量的飼料在屠宰前測定血漿Ghrelin水平高于給予低能量飼料的；當(dāng)攝入能量相同時(shí)，干物質(zhì)攝入并不影響公牛血漿Ghrelin水平［25］。荷斯坦母牛在飼喂前30min和飼喂后30min檢測發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈和門靜脈的血漿Ghrelin濃度飼喂后比飼喂前低；并且在每天飼喂2次的組飼喂前Ghrelin的峰值高于每天飼喂4次的組［26］。這些研究表明攝食可能影響反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌，同時(shí)Ghrelin的水平也會(huì)因?yàn)轱曫B(yǎng)方案的改變而改變。

3.2 Ghrelin分泌的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)

動(dòng)物有機(jī)體是一個(gè)統(tǒng)一的整體，既然Ghrelin可影響其它激素的分泌，內(nèi)分泌系統(tǒng)也可能調(diào)控Ghrelin的分泌。Yannaing S等［27］研究報(bào)道給7月齡的荷斯坦去勢公牛（243kg±7kg）靜脈注射10 μg／kg體重硫酸化膽囊收縮素-8（sCCK-8），注射后血漿?；疓hrelin 比注射前增高并在注射后60 min達(dá)到峰值。同樣在荷斯坦去勢公牛靜脈注射內(nèi)皮素，檢測到血漿?；疓hrelin、總Ghrelin和GH的濃度均增加，并且該過程可能是通過內(nèi)皮素B 受體亞型介導(dǎo)的［28］。荷斯坦去勢公牛靜脈注射牛硫酸化胃泌素顯著地上調(diào)?；疓hrelin、總Ghrelin和GH 的血漿水平，并呈劑量依賴性關(guān)系［29］，而給這些牛靜脈注射蛙皮樣肽［BLPs，包括神經(jīng)介素C（NMC）、神經(jīng)介素B（NMB）和胃泌激素釋放肽（GRP）］發(fā)現(xiàn)任何一種蛙皮樣肽對Ghrelin的水平都沒有影響［30］。2周歲的去勢公羊在48h禁食后靜脈輸注牛胰多肽（PP）180 min，在160、170、180 min時(shí)可降低血漿Ghrelin水平［31］。用膽堿能受體阻斷劑和激動(dòng)劑證明膽堿能活性能夠抑制公羊Ghrelin的分泌［32］，可見膽堿能神經(jīng)元可能調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌。在切除卵巢并第三腦室輸注雌激素的母羊證實(shí)Ghrelin的分泌具有季節(jié)依賴性并受到光周期的調(diào)節(jié)，并且瘦素是Ghrelin分泌的重要因素［33］。以上研究結(jié)果表明膽囊收縮素、內(nèi)皮素、胃泌素、胰多肽和乙酰膽堿等激素均可調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌，但是這些激素調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin分泌的機(jī)制以及還有哪些激素能夠調(diào)控反芻動(dòng)物Ghrelin的分泌值得進(jìn)一步探究。

4 總結(jié)

從Ghrelin 發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有十余年，隨著對Ghrelin及其受體對人或動(dòng)物的生長、能量代謝、攝食、消化道、心肺和免疫功能影響的揭示，Ghrelin的研究已經(jīng)成為內(nèi)分泌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Ghrelin的大多數(shù)研究主要集中在人或鼠類，而對于家畜，尤其是反芻動(dòng)物的研究較少，甚至罕見關(guān)于反芻動(dòng)物Ghrelin受體的研究報(bào)道。其次，Ghrelin或其類似物將來是否可能作為飼料添加劑調(diào)控動(dòng)物攝食和生長，在反芻動(dòng)物Ghrelin水平是否真的就能夠作為食欲高低的一個(gè)指標(biāo)這些均有待于進(jìn)一步探討。因此，針對反芻動(dòng)物的Ghrelin及其受體功能更廣泛和深入的研究具有重要的理論和生產(chǎn)實(shí)踐意義。

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