羊肚菌分子分類及人工培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

才曉玲，何 偉，安福全，于龍鳳*

（1.臨滄師范高等?？茖W(xué)校，云南臨滄 677000；2.臨滄市第三中學(xué)，云南臨滄 677000）

羊肚菌分子分類及人工培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

才曉玲1，何 偉2，安福全1，于龍鳳1*

（1.臨滄師范高等?？茖W(xué)校，云南臨滄 677000；2.臨滄市第三中學(xué)，云南臨滄 677000）

對羊肚菌的分子分類研究及人工培養(yǎng)等方面進(jìn)行了綜述，旨在為羊肚菌的深入開發(fā)利用提供一定的方向和依據(jù)。

羊肚菌；分子分類；人工培養(yǎng)

羊肚菌，又稱美味羊肚菌，別名羊肚菜、羊肚蘑、地羊肚子、木耳蘑菇、編笠菌、陽雀菌、蜂窩落等，因其菌蓋表面生有許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名，它是一種野生名貴食（藥）用真菌之一，有“食用菌皇后”之美譽(yù)〔1-4〕。多年來，僅美國Garry Mill初步實(shí)現(xiàn)了羊肚菌的工廠化栽培，并被美國DNP公司獨(dú)家購買應(yīng)用。在國內(nèi)，朱斗錫對羊肚菌的工廠化栽培試驗(yàn)雖已進(jìn)行多年，但還未取得成功〔5〕。為了加快這一名貴食（藥）用菌的開發(fā)，筆者綜述了近年來國內(nèi)外羊肚菌的研究現(xiàn)狀。

1 分子水平分類研究

羊肚菌屬（Morchella Dill.ex Pers.），于1794建立〔6〕，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）盤菌綱（Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellacea）〔2〕。羊肚菌屬是世界上著名的大型真菌之一，分布廣泛，根據(jù)Boudier分類系統(tǒng)，羊肚菌分為4組（真生組、開裂組、假真生組和紙質(zhì)組），2亞組（肉質(zhì)亞組、半肉質(zhì)亞組），3族（高族、圓族和普通族）。Guzman＆Tapia認(rèn)為根據(jù)羊肚菌屬的總體形態(tài)可將其分為3個類群：黑羊肚菌、黃羊肚菌和半開羊肚菌〔7〕。當(dāng)前國際上公認(rèn)的羊肚菌科下分3屬，分別為羊肚菌屬（Morchella）、鐘菌屬（Verpa）、皺盤菌屬（Disciotis）〔8〕。據(jù) Emile Jacguetant在《LeMorilles》一書中報道，羊肚菌屬共有28個種，目前，世界上羊肚菌有效記錄物種單元為217個（包括亞種和變種）〔9〕，已經(jīng)發(fā)表的羊肚菌屬有33個種（包括亞種和變種），主要分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲等地區(qū)〔10〕。

在我國，羊肚菌最早收錄于李時珍的《本草綱目》〔11〕。鄧叔群在《中國的真菌》中記載了5種，中國菌物學(xué)家戴芳瀾報道了8種〔12〕。至今，中國已報道羊肚菌屬真菌達(dá)22種〔13-16〕，在這22種內(nèi)，有研究者認(rèn)為小羊肚菌（M.deliciosa）、美味羊肚菌（M. esculenta）與粗柄羊肚菌（M.crassipes）可能分別屬于同一生物學(xué)種的早、中、晚3個發(fā)育階段；黑脈羊肚菌（M.angusticeps）、尖頂羊肚菌（M.conica）與高羊肚菌（M.elata）也可能分別屬于同一生物學(xué)種的早、中、晚3個發(fā)育階段〔17〕。Volk和Leonard根據(jù)菌絲融合試驗(yàn)認(rèn)為小羊肚菌、美味羊肚菌和粗柄羊肚菌在遺傳上應(yīng)該存在密切關(guān)系；Gessner、Yoon也支持Volk等的觀點(diǎn)〔18-20〕。當(dāng)前，人們利用同工酶、全序列PCR/RFLP、RAPD的分析認(rèn)為，羊肚菌屬真菌在其形態(tài)分類種的基礎(chǔ)上可能進(jìn)一步劃分為4個大的分類群：黃色羊肚菌群（Yellow morel）、黑色羊肚菌群（Black morel）、半開羊肚菌群（Half morel）和紅褐色羊肚菌群（Red-brownblushing morel）〔21-23〕。但劉文叢等〔24〕應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記法對滇西北地區(qū)56種羊肚菌遺傳多樣性分析，認(rèn)為中國已有記錄的眾多羊肚菌種可以合并為2個復(fù)合種，聚類結(jié)果與地理距離有明顯的相關(guān)性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，垂直板淀粉電泳酶分析〔25-26〕、rDNA ITS序列測定〔27-28〕、rDNA ITS的PCR-RFLPs分析〔29〕、IGS分析〔29〕和微衛(wèi)星序列分析〔30〕等手段已在羊肚菌鑒定上得到使用。研究者通過同工酶分析認(rèn)為小美味羊肚菌（M.deliciosa）的菌株應(yīng)歸類到美味羊肚菌M. esculenta〔26〕，通過RAPD技術(shù)對羊肚菌居群的多樣性研究，可以較為真實(shí)地反映羊肚菌的遺傳特性，陳吉岳等運(yùn)用RAPD分析把國內(nèi)15個供試羊肚菌菌株完全區(qū)別開來〔31〕。但由于種內(nèi)多樣性豐富，用RAPD技術(shù)對單一菌株進(jìn)行研究會出現(xiàn)差異大而將同一種鑒定為不同種。研究者對北美羊肚菌的DNA研究，結(jié)果表明只有3種基本的羊肚菌類型，即黑色（black）、黃色（yellow）和半自由（half-free），許多被定為種的羊肚菌都被歸入3個真實(shí)的種，而且同一個種在地理學(xué)上的孤立群體有可能被明顯地分為2個不同的種〔28〕，Goldway等研究顯示來自以色列Dan Nature Reserve地區(qū)的尖頂羊肚菌M.conica DNA-PCR指紋圖譜與包括毗鄰地區(qū)在內(nèi)的任何地區(qū)的該羊肚菌指紋圖譜都不同。此外，在熱帶和亞熱帶地區(qū)還有一個羊肚菌菌種變紅的分類群，包括紅褐羊肚菌（M.rufobrunnea）、危地馬拉羊肚菌（M. guatemalensis）和硬羊肚菌（M.regidoides）〔32〕。綜上所述，對于羊肚菌屬系統(tǒng)分類主要在類群的劃分及種的鑒定方面存在著分歧，對于羊肚菌種的鑒定還需要不斷地探索和研究。

2 人工培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)基質(zhì)在實(shí)現(xiàn)食用菌人工培養(yǎng)的過程中，栽培基質(zhì)的選擇是重要環(huán)節(jié)之一〔2〕。張松等〔33〕研究表明碳、氮源濃度和培養(yǎng)溫度、pH等是食用菌生長與代謝的重要條件。董雪等〔34〕研究發(fā)現(xiàn)菌株Me11和Me12均在25℃的酵母膏培養(yǎng)基中長勢最好，王廣耀等〔35〕篩選出以馬鈴薯、葡萄糖、玉米粉、豆餅等為主原料的最佳母種培養(yǎng)基，研究者分別以陜北羊肚菌M延-5（采自南泥灣山區(qū)）、羊肚菌Sn-l菌株（采自沈陽天柱山）、羊肚菌LWY-1（采自遼寧朝陽羊山村河套楊樹林）、羊肚菌M.E.194（采自新疆天山腳下葡萄園）、黑脈羊肚菌（M.angusticeps）為研究材料，發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌絲生長的最佳碳源有可溶性淀粉〔36-42〕、葡萄糖〔43-46〕、蔗糖和白糖〔47〕，最適氮源是尿素〔36-38，43〕、天冬氨酸〔40〕、半胱氨酸和亞硝酸鈉〔40〕、硝酸鉀、硝酸鈉〔39，45〕、蛋白胨〔46，48〕、魚粉和豆粕粉〔47〕。不同來源的羊肚菌最佳碳、氮源不同，因?yàn)椴煌N（株）的羊肚菌對營養(yǎng)條件和環(huán)境條件的要求不同；即使同一菌株在不同的營養(yǎng)條件下，菌絲的形態(tài)、顏色等培養(yǎng)特征也不完全相同，這些差異反映了羊肚菌生理特性的多樣性。

2.2 液體深層發(fā)酵隨著人們對羊肚菌的需求日益擴(kuò)大，野生羊肚菌已不能滿足市場的需求，由于羊肚菌菌絲體與子實(shí)體含有相同的營養(yǎng)成分〔49〕，這就使液體培養(yǎng)成為一個重要的研究方向。謝占玲等〔42〕認(rèn)為最適合液體發(fā)酵的菌株為M.angusticeps，劉衛(wèi)紅等〔50〕采用玉米粉、葡萄糖、黃豆粉等為培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)液體羊肚菌菌種具有發(fā)菌快，菌齡一致的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)快速規(guī)?；a(chǎn)。也有研究〔51〕表明采用PDG培養(yǎng)基，其生物量明顯高于YGJ，加腐殖質(zhì)酸（濃度1/700）對羊肚菌的生長具有刺激作用；研究〔52〕表明以PDA母種培養(yǎng)基，添加草木灰濃度為20 g/L時，尖頂羊肚菌菌絲及菌核在數(shù)量和質(zhì)量上都最佳。歐超〔53〕認(rèn)為羊肚菌液體深層發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基配比為：玉米粉4.0 g/dL、葡萄糖1.0 g/dL、黃豆粉2.0 g/dL、酵母粉0.3 g/dL、KH2PO40.2 g/dL、MgSO40.1 g/dL、CaSO40.1 g/dL；最優(yōu)培養(yǎng)條件為：24℃，起始pH 5.8，250 mL的搖瓶裝液量為100 mL，接種量10 mL，搖瓶轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵時間為108 h；也有研究〔54〕認(rèn)為羊肚菌液體發(fā)酵適宜條件為：22℃、pH7.0、120 r/min，10%接種量，裝量100 mL/250 mL。羊肚菌（GIM 5.69）產(chǎn)生胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為：蔗糖3.98%，培養(yǎng)時間5.98 d，轉(zhuǎn)速217.44 r/min〔55〕。此外，研究者〔56〕還發(fā)現(xiàn)羊肚菌（M延-5）發(fā)酵液的pH值的變化與菌絲體產(chǎn)量呈正比關(guān)系，可以把培養(yǎng)液pH值的變化作為培養(yǎng)過程中監(jiān)測發(fā)酵終點(diǎn)的指標(biāo)。

3 存在問題及展望

當(dāng)前，關(guān)于羊肚菌種的劃分，盡管運(yùn)用分子學(xué)生物手段做了大量的研究，但是依然存在一些問題，如在分類上，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究會得到相悖的結(jié)論，需要做更深入的研究。人們對羊肚菌生物學(xué)特性雖然有了一定的了解，但要實(shí)現(xiàn)羊肚菌大規(guī)模人工栽培及工廠化生產(chǎn)依然是真菌學(xué)家急需攻克的難題。人們對羊肚菌菌絲培養(yǎng)及液體發(fā)酵研究和利用已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，尤其是近年來仿生栽培學(xué)的深入研究，研究者已經(jīng)掌握了羊肚菌自然狀態(tài)下的生長因子，相信在不久的將來在中國一定也可以實(shí)現(xiàn)羊肚菌的商業(yè)化栽培。

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Present Situation on Molecular Taxonomy and Artificial Cultivation of Morchella

CAI Xiaoling1，HE Wei2，AN Fuquan1，YU Longfeng1*
（1.Lincang Teachers’College,Lincang，Yunnan 677000,China；2.No.3 Middle School of Lincang,Lincang，Yunnan 677000,China）

The research advance in Morchella,including molecular taxonomy and artificial cultivation is summarized in order to provide a basis for further development and utilization.

Morchella；molecular taxonomy；artificial cultivation

S646

A

1672-2345（2013）04-0044-04

臨滄師范高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)、基礎(chǔ)應(yīng)用研究基金資助項(xiàng)目（LCSZL2012009）

2012-08-28

2012-10-15

才曉玲，講師，主要從事土壤與植物營養(yǎng)研究.

（責(zé)任編輯 毛本勇）

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.04.012

*通信作者：于龍鳳，教授.