八角茴香提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜的觸殺和驅(qū)避活性

何玉杰 花日茂 李世廣 李茂業(yè) 黃衍章 沈宗海

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院1，合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院2，合肥 230036)

(合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院3，合肥 230036)

(安徽中谷國(guó)家糧食儲(chǔ)備庫(kù)4，合肥 230031)

長(zhǎng)角扁谷盜Cryptolestes pusillus(Sch?nherr)屬鞘翅目扁甲科，全世界廣泛分布，中國(guó)普遍分布，是一種后期性倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)，為害破碎和損傷的糧食、豆類(lèi)、油籽類(lèi)、副產(chǎn)品及各種粉類(lèi)、干果、香料等，是糧食倉(cāng)庫(kù)、加工廠、藥材庫(kù)、醬品廠的常見(jiàn)害蟲(chóng)[1]，經(jīng)常發(fā)生在玉米象、谷蠹等初期性倉(cāng)蟲(chóng)危害之后，條件適宜時(shí)，易大量發(fā)生引起儲(chǔ)糧發(fā)熱、結(jié)塊、霉變。

由于長(zhǎng)期單一使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)，包括長(zhǎng)角扁谷盜在內(nèi)的許多害蟲(chóng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[2]，在提高使用劑量與增強(qiáng)抗性之間形成惡性循環(huán)。更嚴(yán)重的是，糧食中化學(xué)農(nóng)藥殘留量的嚴(yán)重超標(biāo)及對(duì)環(huán)境的污染，直接影響出口和施藥者及消費(fèi)者的健康，人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全問(wèn)題的擔(dān)心和憂慮與日俱增，所以研究和探索使用高效低毒或無(wú)毒的物質(zhì)來(lái)防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)是實(shí)現(xiàn)綠色儲(chǔ)糧，保證食品安全與人類(lèi)健康的要求。植物源殺蟲(chóng)劑具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如選擇性強(qiáng)，對(duì)非靶標(biāo)生物相對(duì)安全；易降解，殘留低，一般不污染環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品；因其是天然的混配復(fù)劑，害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性；屬于“環(huán)境和諧農(nóng)藥”，符合農(nóng)產(chǎn)品安全和人類(lèi)發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)藥所追求的目標(biāo)[3]。因此，植物源殺蟲(chóng)劑的研究和應(yīng)用得到了國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的極大重視[4－8]，成為現(xiàn)代農(nóng)藥發(fā)展的主流和熱點(diǎn)之一。

八角茴香(Illicium verumHook.F.)別名八角、大茴香、大料，為木蘭科八角茴香的干燥成熟果實(shí)，是衛(wèi)生部2002年3月5日公布的“既是食品又是藥品”的物品之一。八角茴香屬常綠喬木，原產(chǎn)于中國(guó)西南地區(qū)和越南等亞熱帶地區(qū)。中國(guó)廣西、云南、廣東、福建、貴州等省(區(qū))均有栽培，中國(guó)八角種植面積和產(chǎn)量均占世界的80%以上[9]。

目前，對(duì)八角茴香的研究主要集中在食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[9－10]。八角整?？捎糜谂腼冋{(diào)味，粉狀可用于肉類(lèi)制品等，為“五香粉”的主要原料，有去腥、殺菌、防腐的作用。八角茴香精油是用八角的果實(shí)、種子、葉提煉出的芳香油，可作香精，是食品、甜酒、飲料、卷煙、香水、香皂、牙膏、化妝品等日化產(chǎn)品的增香劑。八角茴香性辛溫，味甘，具有溫陽(yáng)散寒、理氣止痛的功效，中醫(yī)臨床用來(lái)治療胃寒嘔吐、疝氣腹痛、腎虛腰痛、除干濕腳氣、治神經(jīng)衰弱等，從八角提取的莽草酸可生產(chǎn)用于治療人禽流感的抗感冒藥——達(dá)菲。國(guó)內(nèi)外也有研究表明，八角茴香精油對(duì)玉米象(Sitophilos zeamaisMotsehulsky)、德國(guó)小蠊(Blattella germanica)等害蟲(chóng)具有驅(qū)避、熏蒸等生物活性[11－12]。

為了進(jìn)一步確定八角茴香在儲(chǔ)糧害蟲(chóng)防治中應(yīng)用的可能性，用3種有機(jī)溶劑對(duì)八角茴香干果進(jìn)行提取，驗(yàn)證提取物對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)主要的后期害蟲(chóng)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的觸殺和驅(qū)避作用，為今后將八角茴香開(kāi)發(fā)成為新型綠色儲(chǔ)糧保護(hù)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DD－120B電動(dòng)植物粉碎機(jī):浙江溫嶺市大海藥材器械廠；GRX－9071B烘箱:上海?，斣O(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱:廣東醫(yī)療器械廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS－1):上海亞榮生化儀器廠；FA2104電子天平:上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。甲醇(沸點(diǎn)64.5℃)、乙酸乙酯(沸點(diǎn)77.2℃)、石油醚(沸程60～90℃)、丙酮(沸點(diǎn)56.0℃):上海振企化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試蟲(chóng)的采集與飼養(yǎng)

長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)采自安徽中谷國(guó)家糧食儲(chǔ)備庫(kù)，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)。將放入烘箱(100℃)中消毒2 h后的小麥，調(diào)整含水量至(13±1)%，再粉碎為全麥粉，然后以1/4全麥粉質(zhì)量的整粒小麥與全麥粉混合分裝于罐頭瓶中。接入試蟲(chóng)后，置于養(yǎng)蟲(chóng)室，在溫度(28±1)℃，相對(duì)濕度(75±5)%，全黑暗的條件下飼養(yǎng)。7 d后排除成蟲(chóng)，待新一代成蟲(chóng)大量羽化后7～10 d，篩出成蟲(chóng)供試驗(yàn)用。

1.3 供試植物

八角茴香干果:市售，產(chǎn)地為廣西。

1.4 八角茴香提取物的制備

將八角茴香果實(shí)在60℃烘箱中烘干，用電動(dòng)粉碎機(jī)將其粉碎成粉末，過(guò)40目篩。分別稱取適量粉末干樣，加入5倍的溶劑置于室溫(25℃)下，避光浸提48 h，過(guò)濾出溶劑。再按上述步驟浸提2次，集合3次濾液，得到粗提物。將所有的粗提物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至再無(wú)溶劑滴出，稱重，并計(jì)算提取率。提取物裝在棕色瓶?jī)?nèi)，置于4℃冰箱中備用。

1.5 生物活性測(cè)定方法

1.5.1 觸殺作用的測(cè)定

采用濾紙藥膜法并稍加改進(jìn)[4]。將直徑9 cm的濾紙放入相同直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)，在濾紙上放置內(nèi)徑8 cm，高5 cm內(nèi)壁涂有聚四氟乙烯的玻璃環(huán)防止試蟲(chóng)上爬。用丙酮將各溶劑提取物均稀釋成不同濃度的藥液，用移液槍取各稀釋液1 mL，滴入濾紙上藥液被完全吸收，待丙酮完全揮發(fā)后，按每皿30頭接入試蟲(chóng)，皿內(nèi)不加飼料，蓋上鐵絲網(wǎng)，防止試蟲(chóng)逃逸。濾紙滴入純丙酮1 mL作空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將各處理放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(T:27～29℃，RH:70%～80%)，分別于處理24、48、72 h調(diào)查試蟲(chóng)死亡數(shù)。處理72 h后，將試蟲(chóng)轉(zhuǎn)入盛有40 g半碎小麥的廣口瓶?jī)?nèi)，用白布?jí)K封住管口，置于養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)飼養(yǎng)7 d后，檢查觸殺效果。以毛筆觸及試蟲(chóng)無(wú)任何反應(yīng)者為死亡標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算死亡率，并用 Abbott公式校正。

1.5.2 驅(qū)避作用的測(cè)定

采用濾紙藥膜法并加以改進(jìn)[4]。將直徑為9 cm的濾紙剪成相同兩半，一半用移液管分別移取不同濃度的藥液0.5 mL均勻注于濾紙上，室溫下使丙酮揮發(fā)；另一半滴入同體積的丙酮，揮發(fā)干后作為對(duì)照。將兩半濾紙重新接上，用黏膠紙固定后置于同直徑培養(yǎng)皿內(nèi)。皿底涂抹固體膠，防止試蟲(chóng)鉆入濾紙下面。將內(nèi)徑8 cm，高5 cm內(nèi)壁涂有聚四氟乙烯的玻璃環(huán)放入培養(yǎng)皿中，防止試蟲(chóng)上爬。每皿接入30頭試蟲(chóng)，皿內(nèi)不加飼料，加上鐵絲網(wǎng)蓋防止試蟲(chóng)逃逸。重復(fù)3次。將各處理放入養(yǎng)蟲(chóng)室中，分別于24、48、72 h時(shí)后檢查處理邊和對(duì)照邊的蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算驅(qū)避率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

提取率＝濃縮后提取物重/植物干粉重×100%

校正死亡率＝(處理組死亡率－對(duì)照組死亡率)/(1－對(duì)照組死亡率)×100%

驅(qū)避率＝(對(duì)照邊蟲(chóng)數(shù)－處理邊蟲(chóng)數(shù))/對(duì)照邊蟲(chóng)數(shù)×100%

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí)，即無(wú)驅(qū)避作用；Ⅰ級(jí)＝0.01%～20%驅(qū)避率；Ⅱ級(jí)＝20.01%～40%驅(qū)避率；Ⅲ級(jí)＝40.01%～60%驅(qū)避率；Ⅳ級(jí)＝60.01%～80%驅(qū)避率；Ⅴ級(jí) ＝80.01%～100%驅(qū)避率[13]。

用DPS軟件計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和致死中量(LD50)，并采用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)比較各處理的死亡率和驅(qū)避率的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)八角茴香干果的提取效果

由表1可以看出，3種有機(jī)溶劑對(duì)八角茴香干果的提取率以甲醇最高，乙酸乙酯和石油醚次之。在同樣條件下不同溶劑對(duì)八角茴香干果的提取效率不同，其原因是溶質(zhì)在溶劑中溶解符合“相似相容”規(guī)律，待浸取成分與溶劑的分子極性越相似，其溶解度越大。甲醇、乙酸乙酯、石油醚的極性依次為:6.6、4.4、0.0，因此，推測(cè)八角茴香干果中極性物質(zhì)的含量較高。

表1 3種有機(jī)溶劑對(duì)八角茴香干果的提取率

2.2 八角茴香提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的生物活性

2.2.1 觸殺活性

分別設(shè)計(jì)了5個(gè)處理劑量，采用濾紙藥膜法來(lái)測(cè)定八角茴香3種溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的觸殺效果，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中看出，3種提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)均具有很強(qiáng)的觸殺作用，且3種提取物的觸殺效果均隨著處理劑量的增加而顯著增強(qiáng)；同種溶劑提取物在相同處理劑量下，其觸殺效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。用最大劑量148.63μg/cm2處理72 h后，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對(duì)試蟲(chóng)的校正死亡率分別為87.85%、90.98%和94.44%。

表2 八角茴香干果的3種溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的觸殺作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

將表2中八角茴香干果的甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物的處理劑量與長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)處理72 h的平均死亡率之間的關(guān)系，進(jìn)行毒力回歸直線分析，得到這3種提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的觸殺毒力回歸方程和LD50(見(jiàn)表3)。由表3可知，八角茴香干果的甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物處理長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)72 h后的LD50分別為28.21、23.51和19.23μg/cm2，觸殺效果最好的是石油醚提取物，其次是乙酸乙酯提取物，最后是甲醇提取物。

表3 八角茴香干果的3種溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)處理72 h后的觸殺毒力回歸分析

2.2.2 驅(qū)避活性

由表4可知:八角茴香的同種溶劑提取物的劑量越高，其對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)驅(qū)避作用越大；甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種溶劑提取物的最高劑量(123.46μg/cm2)的平均驅(qū)避率分別為:62.23%、73.22%和40.16%，其驅(qū)避等級(jí)分別為Ⅳ級(jí)、Ⅳ級(jí)和Ⅲ級(jí)；八角茴香3種有機(jī)溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)驅(qū)避作用大小依次為:乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞石油醚提取物。同種溶劑提取物在相同劑量下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其驅(qū)避作用整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于藥液的揮發(fā)導(dǎo)致濃度下降，使得驅(qū)避作用下降；另外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，八角茴香的3種溶劑提取物對(duì)試蟲(chóng)均有一定的麻痹作用，這可能與驅(qū)避率的下降也有一定的關(guān)系。

表4 八角茴香干果的3種溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的驅(qū)避作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討論與結(jié)論

3.1 甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種有機(jī)溶劑對(duì)八角茴香干果的提取率分別為:23.67%、14.21%和14.00%。根據(jù)相似相容的原理，待浸取成分與溶劑的分子極性越相似，其溶解度越大。物質(zhì)的極性與其分子結(jié)構(gòu)和分子大小有關(guān)，根據(jù)生物活性追蹤結(jié)果，對(duì)于已知活性較高的成分，可根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)判斷其極性，再選擇合適的溶劑進(jìn)行浸取分離，從而提高提取效率[14]。

3.2 從八角茴香的3種溶劑提取物的觸殺活性可以看出:3種提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)均具有很強(qiáng)的觸殺作用，觸殺效果隨處理劑量的增加而顯著增強(qiáng)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。用148.63μg/cm2劑量處理72 h后，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對(duì)試蟲(chóng)的致死率分別為87.85%、90.98%和94.44%。從致死中量上看，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)處理72 h后的LD50分別為28.21、23.51和19.23μg/cm2，因此，八角茴香3種溶劑提取物對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的觸殺效果依次為:石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物。

3.3 從3種提取物的驅(qū)避活性可以看出:同種溶劑提取物的劑量越高，對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)的驅(qū)避作用越大；甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種溶劑提取物的最高劑量(123.46μg/cm2)的平均驅(qū)避率分別為:62.23%、73.22%和40.16%，其驅(qū)避等級(jí)分別為Ⅳ級(jí)、Ⅳ級(jí)和Ⅲ級(jí)；對(duì)長(zhǎng)角扁谷盜成蟲(chóng)驅(qū)避作用大小依次為:乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞石油醚提取物。徐漢虹等[15]報(bào)道八角茴香精油在200～800μL/cm2劑量下，對(duì)赤擬谷盜成蟲(chóng)的驅(qū)避作用也能達(dá)到Ⅳ級(jí)以上，但比本試驗(yàn)的處理劑量明顯要高。

3.4 對(duì)八角茴香的化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，干果含精油約8%～12%，精油的主要成分為反式茴香腦——茴香醚(C10H12O)，含量達(dá) 80%以上，尚含茴香醛(C8H8O2)、茴香酮(C10H12O2)、黃樟醚(C10H10O2)等[9]。所以，今后在研制新型殺蟲(chóng)劑的過(guò)程中，若對(duì)其提取物或精油中高活性化合物進(jìn)行分離和鑒定，采用生物活性追蹤的方法研究其活性成分及構(gòu)效關(guān)系，選擇其活性成分較高且結(jié)構(gòu)式相對(duì)簡(jiǎn)單的化合物，進(jìn)行仿生合成和結(jié)構(gòu)改造或直接利用其粗提品，進(jìn)行制劑加工，可望加工成對(duì)原糧和成品糧均有效的谷物保護(hù)劑，既可達(dá)到經(jīng)濟(jì)、高效防治害蟲(chóng)的目的，又可減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，控制害蟲(chóng)抗藥性的發(fā)展，而且對(duì)于推動(dòng)八角及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)

[1]張宏宇.城市昆蟲(chóng)學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009:56－62

[2]馬曉輝，王殿軒，李克強(qiáng)，等.中央儲(chǔ)備糧中主要害蟲(chóng)種類(lèi)及抗性狀況調(diào)查[J].糧食儲(chǔ)藏，2008，37(1):7－10

[3]徐漢虹.殺蟲(chóng)植物與植物性殺蟲(chóng)劑[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.107－133

[4]姚英娟，薛東，楊長(zhǎng)舉.21種植物提取物對(duì)玉米象的生物活性[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2005，48(5):692－698

[5]李世廣，林華峰，劉志紅，等.幾種植物性物質(zhì)防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的研究[J].糧食儲(chǔ)藏，2005，34(1):8－10

[6]黃衍章，楊長(zhǎng)舉，薛東，等.石菖蒲根莖提取物對(duì)玉米象和谷蠹的有效殺蟲(chóng)活性成分初步分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23(1):137－140，156

[7]唐國(guó)文，喬利利，蘇遠(yuǎn)萍，等.胡蘆巴不同溶劑粗提物對(duì)兩種儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的驅(qū)避和觸殺活性[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(6):102－108

[8]Ukeh D A，Birkett M A，Pickett J A，et al.Repellent activity of alligator pepper，Aframomum melegueta，and ginger，Zingiber officinale，against the maize weevil，Sitophilus zeamais[J].Phytochemistry，2009，70(6):751－758

[9]王琴，蔣林，溫其標(biāo).八角茴香的研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2005，18(5):18－22

[10]Wang GW，Hu WT，Huang B K，et al.Illicium verum:A review on its botany，traditional use，chemistry and pharmacology[J].Journal of Ethnopharmacology，2011，136(1):10－20

[11]徐漢虹，趙善歡，周俊，等.八角茴香精油的殺蟲(chóng)活性與化學(xué)成分研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1996，23(4):338－342

[12]Chang，K S，Ahn Y J.Fumigant activity of(E)－anethole identified inIllicium verumfruit againstBlattella germanica[J].Pest Management Science，2002，58(2):161－166

[13]Malik M M，Muiutaba N S H.Screening of some indigenous plants as repellents of antifeedants for stored grain insect[J].Journal of Stored Products Research，1984，20:45－48

[14]宋曉凱.植物化學(xué)研究方法選論[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008:10－15

[15]徐漢虹，趙善歡.五種精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的忌避作用和殺卵作用研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，1995，10(1):1－5.