基于偏最小二乘法的磷脂紅外快速檢測(cè)

丁 洋 魏 敏 孟祥河

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310014)

磷脂是一種重要膳食成分，廣泛存在于大豆、菜籽、葵花籽等油料作物中，在大豆油中，磷脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.1%～1.8%，脫膠以后磷脂的含量約為20 mg/kg[1]。目前，磷脂含量的檢測(cè)方法主要有鉬藍(lán)比色法[2]，重量法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色譜法[5－6]，薄層色譜法[7－8]和31P核磁共振光譜法[9－10]等，其中常用的檢測(cè)方法如高效液相色譜法可對(duì)磷脂單體進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但成本昂貴，而且復(fù)雜的樣品富集前處理同樣不可或缺?？偭字臏y(cè)定常采用鉬藍(lán)比色法，問題是需要耗費(fèi)大量的時(shí)間，并且非磷脂磷會(huì)帶來較大的誤差。

近些年來，隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的研究應(yīng)用，傅里葉變換紅外光譜儀在物質(zhì)成分的定量分析中逐步得到了廣泛的應(yīng)用。Christoph Krafft等[11]利用近紅外、拉曼光譜分析了人腦的磷脂組成及各基團(tuán)的特征吸收峰，但是沒有進(jìn)行定量研究。Nzai等[12]利用中紅外光譜法測(cè)定了大豆毛油中磷脂的含量，采用朗伯－比爾定律的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)的磷分析技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但其背景如何扣除不清楚，方法的準(zhǔn)確性和精確性均不高。Kuligowski等[13]利用凝膠色譜法結(jié)合衰減全反射紅外光譜(FTIR－ATR)研究了大豆油中卵磷脂的含量，但是ATR靈敏度低，不適用于低濃度磷脂的檢測(cè)，并且檢測(cè)之前需要凝膠色譜預(yù)分離，不能直接對(duì)油中的磷脂進(jìn)行檢測(cè)，Aleksandra Szydlowska－Czerniak[14]利用中紅外光譜結(jié)合偏最小二乘法對(duì)生產(chǎn)過程中各階段菜籽油中磷脂的含量進(jìn)行了檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，中紅外光譜在860～1 760 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)能夠很好的確定磷脂的含量，但其方法需要以相應(yīng)的脫磷脂油作對(duì)照，因此使得FTIR/PLS方法樣品處理復(fù)雜化。

本研究以大豆油，葵花油和菜籽油為代表進(jìn)行綜合分析，運(yùn)用偏最小二乘法建立定量分析模型，樣品只需正己烷溶解即可，省去了脫膠油作為對(duì)照的必要性，方法簡(jiǎn)便、快速，效果良好。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正己烷:色譜純Sigma－Aldrich公司；大豆磷脂:廣州市海圣生物科技有限公司，通過鉬藍(lán)比色法測(cè)定其磷脂的含量為911.59 mg/g；精煉大豆油、葵花油、菜籽油:一級(jí)精煉油，市售；其他試劑均為分析純。

Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀:德國(guó)Bruker公司；可見分光光度計(jì):日本島津公司；微波爐:格蘭仕公司；馬弗爐:上海意豐電爐廠。

1.2 樣品的制備

大豆油、葵花油和菜籽油經(jīng)硅膠柱過濾，去除其殘余的微量磷脂。精確稱取大豆磷脂(精確到0.01g)分別溶解在經(jīng)硅膠柱過濾的3種油中，用微波爐加熱60 s，振蕩混勻，制成 200～20 000 mg/kg的磷脂－大豆油/葵花油/菜籽油混合液，精確稱取上述混合液1.00 g，用正己烷稀釋至5.00 g。

1.3 方法

1.3.1 鉬藍(lán)比色法測(cè)量磷脂的含量

鉬藍(lán)比色法采用 GB5537—2008[15]中的方法，植物油中的磷脂經(jīng)灰化后變?yōu)槲逖趸?，后被鹽酸變?yōu)榱姿?，遇鉬酸鈉生成磷鉬酸鈉，然后被硫酸聯(lián)氨還原成鉬藍(lán)，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)650 nm處測(cè)定鉬藍(lán)的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算磷脂的含量。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜參數(shù)設(shè)定及樣品光譜采集

Bruker Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀，檢測(cè)器為RT－DLaTGS，采用100μm CaF2液體樣品池。樣品的光譜采集范圍是400～4 000 cm－1，光譜分辨率是2 cm－1，以空氣作背景，背景和待測(cè)樣品均掃描16次。

樣品光譜采集選用透射的方式，室內(nèi)溫度控制在25℃，濕度保持恒定，每次測(cè)量樣品紅外光譜前，樣品池用正己烷清洗4次，然后用待測(cè)樣品潤(rùn)洗3次，每個(gè)樣品測(cè)量2次，取其平均值作為測(cè)量的結(jié)果。共得到紅外光譜212個(gè)，其中大豆油116個(gè)，葵花油41個(gè)，菜籽油55個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷脂紅外譜圖的分析

從圖1可以看出，其紅外光譜圖在800～1 300 cm－1，1 300～1 520 cm－1，1 700～1 780 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)具有明顯的吸收峰，在2 600～3 100 cm－1范圍內(nèi)具有較寬的吸收峰，其中2 600～3 100 cm－1，1 410～1 570 cm－1為磷脂和三酰甘油中C—H基團(tuán)的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮峰，1748 cm－1處為C＝O的伸縮峰，與磷相關(guān)的基團(tuán)的吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1(圖1a，圖1b)，其中1 246 cm－1為 PO2的不對(duì)稱伸縮峰，1 035 cm－1為P—O—C的對(duì)稱伸縮峰，1 162 cm－1為 C＝O—O—C中 C—O的伸縮峰，1 066 cm－1處為C—O—PO2中C—O—P的不對(duì)稱伸縮峰。然而，CH3，CH2，C＝O和 C—O—C在植物油和磷脂中共同存在，但是由于磷脂中一個(gè)磷酸基團(tuán)替代了普通甘油酯中的一個(gè)C—O—C和C＝O基團(tuán)，C—O—C和C＝O的峰高會(huì)隨著磷脂含量的增加而減少。P＝O，PO2，P—O—C為磷脂中特有的特征吸收峰，它們的峰高會(huì)隨著磷脂含量的增加而增加。在建立磷脂的定量分析模型中，選用800～1 300 cm－1波數(shù)范圍的吸收峰。

圖1 磷脂的傅里葉變換紅外光譜圖

2.2 異常樣品的去除

由于人工操作或者儀器環(huán)境等原因，通常會(huì)產(chǎn)生一些異常樣品，在紅外光譜的測(cè)量中通常會(huì)存在兩類異常樣品，一類是樣品化學(xué)值比較極端，影響模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，但一般能提高模型的適應(yīng)能力，這類異常樣品可以用馬氏距離(杠桿值)來剔除。另一類就是測(cè)量樣品的參考測(cè)量值有誤，其誤差范圍超出了標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍，該樣品不能用于模型的建立，這類異常樣品可用學(xué)生殘差予以剔除。如果樣品的化學(xué)值確實(shí)準(zhǔn)確無誤或者該樣品對(duì)模型的準(zhǔn)確度影響不大，那么馬氏距離判定的異常樣品在一般情況下不予剔除，這樣可以保證模型的廣泛適用性，學(xué)生殘差判定的異常樣品一般需要剔除。

圖2 磷脂樣品紅外光譜的馬氏距離排序圖及學(xué)生殘差分布圖

本試驗(yàn)異常樣品的去除是通過馬氏距離結(jié)合學(xué)生殘差進(jìn)行的，圖2為其馬氏距離排序圖和學(xué)生殘差值分布圖。從圖2中可以看出，782.03 mg/kg和899.33 mg/kg這兩個(gè)質(zhì)量濃度的樣品的馬氏距離高于其他樣品，同時(shí)這兩個(gè)樣品的學(xué)生殘差較大，因此認(rèn)定這兩個(gè)樣品為異常樣品，在建模的過程中予以去除，其他樣品馬氏距離較小，學(xué)生殘差分布集中，因此作為有效樣品應(yīng)用于建模分析。

2.3 模型的建立與優(yōu)化

2.3.1 建模樣品的選擇

在待測(cè)樣品中隨機(jī)挑選141個(gè)樣品作校正集，最小質(zhì)量濃度213.28 mg/kg，最大質(zhì)量濃度19 967.73 mg/kg，平均質(zhì)量濃度是 7 038.79 mg/kg。其余的 69個(gè)樣品作為驗(yàn)證集，最小質(zhì)量濃度445.97 mg/kg，最大質(zhì)量濃度 18 642.50 mg/kg，平均質(zhì)量濃度是7 449.30 mg/kg。

2.3.2 光譜預(yù)處理對(duì)建立模型的影響

采用TQ Analyst紅外定量分析軟件對(duì)測(cè)得的紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理及分析，通過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，可以減弱以至消除各種非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響，凈化譜圖信息，為校正模型的建立、未知樣品組成或性質(zhì)預(yù)測(cè)奠定一定的基礎(chǔ)。預(yù)處理過程包括SNV、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、卷積平滑等[16]，通過分析不同預(yù)處理方法對(duì)模型各性能的影響確定合適的預(yù)處理方法。表1為偏最小二乘回歸結(jié)合不同的預(yù)處理方法建立紅外定量分析模型的分析結(jié)果。

表1 基于偏最小二乘結(jié)合不同的預(yù)處理方法建立磷脂含量模型的分析

從表1中可以看出采用原始光譜、SNV、9階平滑處理的效果好于其他樣品預(yù)處理的方法，其主成分?jǐn)?shù)都為10，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.995 2、0.996 8和0.996 1。在后續(xù)的分析過程中將對(duì)原始光譜，SNV和9階平滑處理得到的光譜進(jìn)行比較。

2.3.3 波數(shù)范圍及主成分?jǐn)?shù)對(duì)建立模型的影響

偏最小二乘法是一個(gè)全光譜的方法，然而在有些情況下，光譜噪聲或者樣品中出現(xiàn)的附加組分會(huì)造成PLS算法解析這些特征，從而使模型的穩(wěn)定性降低。這時(shí)就需要選擇PLS回歸的頻率范圍，并使譜圖包含所有的特征官能團(tuán)，磷脂的特征吸收峰主要集中在800～1 300 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)，因此在選擇建模的波數(shù)范圍時(shí)，這個(gè)波數(shù)范圍將重點(diǎn)考慮。表2列出了不同波數(shù)范圍對(duì)建立模型的分析結(jié)果。

表2 基于偏最小二乘回歸結(jié)合不同波數(shù)范圍所建磷脂含量模型的分析結(jié)果

從表2的數(shù)據(jù)中可以看出，970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)所建的模型性能最好，主成分因子數(shù)較低，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，RMSEC和RMSEP均較小。在這個(gè)波數(shù)范圍內(nèi)主要是磷脂中與P—O—C，PO2，P＝O等與磷有關(guān)的基團(tuán)的特征吸收峰，受其他成分的干擾較少，并且根據(jù)朗伯－比爾定律，其吸光度隨磷脂含量的增加而增加，有很好的線性關(guān)系，因此所建模型最好。除與磷有關(guān)的特征峰以外，磷脂中的另一個(gè)特征基團(tuán)就是1 710～1 780 cm－1范圍內(nèi)的羰基的吸收振動(dòng)峰，經(jīng)分析，由于磷脂中含有的羰基少于油脂中的羰基，所以羰基的吸收峰隨著磷脂含量的增加而減少，但是采用這個(gè)波數(shù)范圍建立的模型效果并不好，原因可能是油中的羰基含量太高而磷脂的含量對(duì)它的影響很小，或者可能是這個(gè)波數(shù)范圍太窄，不能包含磷脂紅外光譜的所有信息。同樣，970～1 320 cm－1結(jié)合1 710～1 780 cm－1同樣受到C＝O的影響，導(dǎo)致結(jié)果不理想，另外采用全波數(shù)建模相關(guān)系數(shù)較差，并且RMSEC和RMSEP均較大，原因可能是建模過程中無用的信息太多，影響了建模效果。

另外，采用PLS法建立定量分析模型時(shí)，主成分?jǐn)?shù)的選擇將直接影響到模型的預(yù)測(cè)能力。使用的主成分?jǐn)?shù)過多，會(huì)引入一些噪音，使用的主成分?jǐn)?shù)過少，則不能充分反映樣品的光譜信息，這都將降低模型的預(yù)測(cè)能力，本次分析通過留一交互驗(yàn)證法，當(dāng)交互驗(yàn)證均方差(RMSECV)和預(yù)測(cè)殘差平方和(PRESS)均較小時(shí)，所選主成分?jǐn)?shù)最好。通過分析在970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)，SNV，9階平滑處理的光譜和原始光譜的主成分?jǐn)?shù)分別為4、5、5。

結(jié)合光譜的預(yù)處理可以得到，經(jīng)SNV處理的紅外光譜，在970～1 320 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)建立的模型為最優(yōu)化模型。其主成分?jǐn)?shù)為4，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 9，RMSEC和 RMSEV分別為316、386。

2.4 模型的驗(yàn)證

2.4.1 FTIR/PLS模型準(zhǔn)確值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)關(guān)系

圖3給出了200～20 000 mg/kg范圍的最優(yōu)模型的準(zhǔn)確值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)關(guān)系，從圖中可以看出，樣品的準(zhǔn)確值和預(yù)測(cè)值之間的線性回歸系數(shù)達(dá)到0.997 9，預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確值之間的關(guān)系吻合良好，表明此模型能夠很好的預(yù)測(cè)樣品中磷脂的含量。

圖3 FTIR/PLS模型準(zhǔn)確值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)關(guān)系圖

2.4.2 FTIR/PLS法同鉬藍(lán)比色法測(cè)量結(jié)果的比較

為了驗(yàn)證FTIR方法的有效性，選擇精煉菜籽油，精煉葵花油，大豆毛油，菜籽毛油和經(jīng)過稀釋的磷脂濃縮物5個(gè)樣品，用FTIR/PLS法和鉬藍(lán)比色法分別測(cè)其磷脂的含量，各測(cè)5次，結(jié)果見表3所示。

表3 FTIR/PLS法同鉬藍(lán)比色法測(cè)量結(jié)果的分析

如表3所示，鉬藍(lán)比色法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.48%～3.87%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.47%，而FTIR測(cè)得的磷脂含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.42%～3.52%，平均相對(duì)偏差為2.36%。兩者的平均相對(duì)誤差為0.75%，表明FTIR法能夠代替鉬藍(lán)比色法實(shí)現(xiàn)植物油中磷脂的快速檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究采用了添加大豆磷脂的方式制備樣品，制備的樣品中包含大豆油、葵花籽油、菜籽油，采用偏最小二乘法建立定量分析模型，選用的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可解析譜圖中的特征吸收峰，提取有用信息，降低不同品種油中磷脂組成不同對(duì)結(jié)果的影響。由結(jié)果可知，精確度和準(zhǔn)確度相對(duì)較高，線性關(guān)系和適用性良好，與HPLC，鉬藍(lán)比色法等相比簡(jiǎn)單快速，不需要復(fù)雜的樣品處理過程，該方法適合不同磷脂含量(200～20 000 mg/kg)油脂樣品的快速檢測(cè)。

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