響應面法優(yōu)化水楊酸比色測定還原糖的研究

朱凱杰 陸國權 張 遲

(浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，臨安 311300)

DNS比色法即3，5－二硝基水楊酸比色法的測定原理是3，5－二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物——3－氨基－5－硝基水楊酸，在一定范圍內，還原糖的量和反應液的顏色呈正比[1－2]。因此，可以通過測經(jīng)比色后的分光光度值來測定還原糖的量，從而間接測定作物中的淀粉含量。現(xiàn)今，由于此方法的實用性和準確性，已被廣泛應用，如劉華等[3]對煙草中的淀粉含量的測定，陸國權等[4]對甘薯中的淀粉含量的測定。但是應用過程中存在著各種DNS配方，且測定結果存在較大差異[5－7]。因此，為滿足各類作物中淀粉的測定，確定一種既準確又方便、快速、經(jīng)濟的DNS比色法的配方勢在必行。

本研究從準確性、實用性、方便性、快速性、經(jīng)濟性、安全性等角度，分析并比較了幾種目前常用的DNS配方的實用效果，通過對現(xiàn)有的DNS配方的比較和篩選，確定一種快速準確，經(jīng)濟實用的DNS配方，并通過響應面的方法對此配方進行了優(yōu)化[8－12]。確定了符合上述要求的最佳配方DNS配方，為各類作物中淀粉還原糖的測定奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

3，5－二硝基水揚酸(簡稱 DNS)、氫氧化鈉(NaOH)、酒石酸鉀鈉、苯酚:亞硫酸鈉:丙三醇:上海試一化學試劑有限公司；0.1%葡萄糖標準溶液(準確稱取100 mg分析純的葡萄糖(預先在105℃干燥至恒重，用少量蒸餾水溶液后定容至100 mL，冰箱保存使用)；試驗所用水為蒸餾水。

1.2 儀器

721－分光光度計:南京凱迪高速分析儀器有限公司；AB104－S標準型分析天平:上海臺衡儀器儀表有限公；HK135熱恒溫水浴鍋:杭州韓工科技有限公司；容量瓶、滴定管、量筒、燒杯、棕色瓶:上海衛(wèi)程科學儀器有限公司；移液槍、1 mL吸嘴:北京華匯通科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 DNS試劑配方的最優(yōu)化篩選

配方1:甲液——溶解6.9 g結晶酚于15.2 mL 10%氫氧化鈉中，并稀釋至69 mL，在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液——稱取255 g酒石酸鉀鈉，加到300 mL 10%氫氧化鈉中，再加入880 mL 1%3，5－二硝基水楊酸溶液。將甲液與乙液相混合即得黃色試劑；貯于棕色試劑瓶中。在室溫下放置7～10 d以后使用。

配方2:稱取6.5 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1 000 mL容量瓶中，加入10%氫氧化鈉溶液260 mL，再加入20 mL丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置7 d。

配方3:(1)以稱取3，5－二硝基水楊酸(C7H4N2O7)6.3 g，氫氧化鈉21.0 g充分溶解于500 mL蒸餾水中(水先煮沸10 min后冷卻)；(2)加入酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O)182.0 g，苯酚(在50℃水中融化)5.0 mL，偏重亞硫酸鈉(NaS2O5)5.0 g，攪拌至全溶，定容至1 000 mL；(3)充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10 d。

配方4:酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5－二硝基水楊酸0.03 g，NaOH2.1 g，苯酚 0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存7 d后使用。

配方 5:將6.3 gDNS和262 mL2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1 000 mL，放置于棕色瓶7 d后使用。

按上述5種配方配置后，按照方法進行標準曲線的制備，并做適當修改:取9支大試管，分別加入標準的葡萄糖溶液，加蒸餾水調節(jié)體積為2 mL，加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加熱5 min，立即用流動冷水冷卻，加入21.5 mL的蒸餾水，搖勻。在721－100型分光光度儀上520 nm處，以空白溶液為參比，測定吸光度(注:本試驗中每個吸光度值均重復測量3次，取其平均值所得)。繪制標準曲線，得出曲線方程。

待上述5條標準曲線繪制好后，更改葡萄糖的加入量為0.5、0.9、1.3 mL，分別加入5種DNS液，再用上述方法測定吸光光度值，帶入各曲線方程，算出測定的葡萄糖值，與標準值相比，計算誤差，并分析比較。

1.3.2 DNS試劑配方的優(yōu)化

針對上述5種配方種，選取一種最佳配方，并對其進行響應面的優(yōu)化。

測定方法:以4支大試管為一組，其中一支中加2 mL蒸餾水，另3支分別加入標準的葡萄糖溶液1 mL，加蒸餾水為1 mL，在4支試管都加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加熱5 min，立即用流動冷水冷卻，加入21.5 mL的蒸餾水，搖勻。在721－100型分光光度儀上520 nm處，以其中的一支空白溶液為參比，測定吸光度。

1.3.3 新DNS配方的驗證試驗

按照DNS試劑配方的最優(yōu)化篩選中的方法對新DNS配方進行驗證，即對其進行吸光度測定，繪制標準曲線和曲線方程，觀察其符合程度和精確度。

1.3.4 淀粉回收率試驗

為檢驗新DNS配方的準確性，進行淀粉回收率試驗。先測純淀粉回收率。方法是稱取0.5 g純淀粉，用鹽酸水解，新DNS配方比色法測定。再測定甘薯加純淀粉回收率，方法是先稱取0.25 g甘薯及0.25 g純淀粉，混合后用新DNS配方進行鹽酸水解－DNS比色法測定。

1.3.5 新DNS配方對甘薯的實際測定結果

為檢驗其實用性和精確性，用新DNS配方和標準DNS配方對20種甘薯中淀粉含量進行測定、比較和分析。

2 結果與分析

2.1 各種DNS配方的曲線繪制、曲線方程以及各種DNS配方的絕對誤差

如圖1所示，其中y1＝1.056 3x1＋0.079 4，R12＝0.999 7；y2＝1.536 2x2＋0.069 1，R22＝0.999 8；y3＝1.047 5x3＋0.098 1，R32＝0.999 7；y4＝2.312 1x4＋0.012 7，R42＝0.986 7；y5＝1.124 5x5＋0.096 2，R52＝0.999 7，分別表示曲線y1、y2、y3、y4、y5的曲線方程，R12、R22、R32、R42、R52表示各配方的試驗數(shù)據(jù)與曲線方程之間的吻合程度。R2值越接近1，吻合程度越高，越接近0，則吻合程度越低。

圖1 5種DNS配方的吸光度測定結果的曲線圖

表1表示各種DNS配方的絕對誤差，是指當葡萄糖為0.5、0.9、1.3 mL時分別測定出吸光度，用測量的吸光度后帶入各自曲線，重復3次，取其平均值，得出的絕對誤差。

由圖1和表1可以分析得出:配方4繪制的曲線，曲線方程均不理想，最后的誤差也最大，與其余4個配方相差太大，這可能是由于配方4中的3，5－二硝基水楊酸用量過少導致的誤差偏大，測定值不精確。而配方1、2、3、5得到的曲線和曲線方程均符合要求，4個配方最后所測的誤差也無顯著性差異。因此，該4種配方的精密度是符合要求的。但考慮到配方1、3、5較為復雜，所需藥品較多，且考慮到它們都要加入劇毒藥品苯酚，因此，從實用性、方便性、快速性、經(jīng)濟性、安全性等角度，選擇配方2進行響應面優(yōu)化。

表1 各種DNS配方的絕對誤差

2.2 單因素試驗

2.2.1 DNS用量的影響

在10%氫氧化鈉260 mL，丙三醇用量為20 mL時，研究不同DNS用量對吸光度值的影響，結果見圖2。從圖2中可以看出，吸光度隨DNS用量的增大而逐漸升高，當DNS用量為7 g之后吸光度值升高相對緩慢，從節(jié)約能源等方面考慮選擇DNS用量為7 g為宜。

圖2 DNS用量對吸光度的影響

2.2.2 氫氧化鈉用量的影響

在DNS用量為7 g，丙三醇用量為20 mL時，研究不同的10%氫氧化鈉用量對吸光度值的影響，結果見圖3。從圖3中可以看出，吸光度隨氫氧化鈉用量的增大而逐漸升高，當10%氫氧化鈉用量為400 mL之后吸光度值升高相對緩慢，從節(jié)約能源等方面考慮選擇氫氧化鈉用量為400 mL為宜。

圖3 氫氧化鈉用量對吸光度的影響

2.2.3 丙三醇用量的影響

在DNS用量為7 g，10%氫氧化鈉用量為400 mL時，研究不同的丙三醇用量對吸光度值的影響，結果見圖4。從圖4中可以看出，吸光度與丙三醇用量沒有關系，故選擇丙三醇用量仍然為20 mL為宜。

圖4 丙三醇用量對吸光度的影響

2.2.4 放置時間的影響

在DNS用量為7 g，10%氫氧化鈉用量為400 mL時，丙三醇用量為20 mL時，研究不同放置時間對吸光度值的影響，結果見圖5。從圖5中可以看出，吸光度值隨放置時間的增加而逐漸升高，但當放置時間為6 d之后，吸光度值升高相對緩慢，故選擇放置時間為6 d為宜。

圖5 放置時間對吸光度的影響

2.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素探索的試驗結果，以10%氫氧化鈉用量、DNS用量、放置時間3個因素為自變量，吸光度為響應值，采用響應面分析法在三因素五水平上對DNS配方進行優(yōu)化，以找到最優(yōu)DNS配方為目的。根據(jù)Box－Benhnken的中心組合設計原理，中心組合試驗的因子及編碼值(表2)。

表2 中心組合試驗的因子及編碼值

對10%氫氧化鈉用量X1、DNS用量X2和放置時間X3各水平進行如下編碼:X1＝(Z1－400)/100，X2＝(Z2－7)/1，X3＝(Z3－6)/1，以X1，X2，X3為自變量，以吸光度Y為響應值，中心試驗設計及試驗結果見表3。

表3 中心試驗設計及試驗結果

表3中試驗1～14為析因試驗，15～20為中心試驗。20個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復6次，用以估計試驗誤差。采用Minitab 15統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸分析結果見表4。

表4 回歸系數(shù)顯著性分析表

對表4數(shù)據(jù)進行回歸分析，獲得吸光度Y對編碼自變量10%氫氧化鈉用量X1、DNS用量X2和放置時間X3的二次多項回歸方程:

Y＝0.565 952＋0.011 658X1＋0.007 911X2＋0.011 525X3－0.005 540X12－0.002 706X22－0.006 258X32－0.003 287X1X2－0.001 137X1X3＋0.003 213X2X3

表5 回歸方程各項的方差分析表

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則相應變量的顯著程度越高。由表4可以看出，方程中X1、X2、X3對響應值的影響為極顯著，而平方項X1X1、X3X3為差異顯著，其余的均為不顯著，表明試驗因子對響應值不是簡單的線性關系。從表5中可以得出，回歸項、線性項、平方項為差異極顯著，而交互作用不顯著?；貧w方程也是高度顯著的，相關系數(shù)R2＝0.005 925/0.006 493＝91.25%。說明響應值(吸光度)的變化有91.25%來源于所選變量，即10%氫氧化鈉用量、DNS用量和放置時間。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。根據(jù)回歸分析結果做出相應的響應曲面圖及其等值線圖，以確認10%氫氧化鈉用量、DNS用量和放置時間三因素對吸光度的影響，結果如圖6～圖8。

圖6 10%氫氧化鈉用量與DNS用量對吸光度的響應面和等值線

圖7 10%氫氧化鈉用量與放置時間對吸光度的響應面和等值線

圖8 DNS用量與放置時間對吸光度的響應面和等值線

從圖6～圖8可以看出，X1和X2的交互作用明顯，即10%氫氧化鈉用量與DNS用量交互作用明顯；而X1與X3，X2與X3交互作用不明顯，即10%氫氧化鈉用量與放置時間，DNS用量與放置時間交互作用不明顯。

2.4 驗證試驗

對回歸方程取一階偏倒數(shù)等于零，整理可得下式。

式(1)、式(2)、式(3)聯(lián)立方程組，解得X1＝0.261，X2＝2.165，X3＝1.451，代入前述的變換公式得到10%氫氧化鈉用量為426.1 mL、DNS用量為9.165 g和放置時間為7.451 d，但考慮到實際操作的便利，將DNS配方修正為10%氫氧化鈉用量為426 mL、DNS用量為9.165 g、放置時間為7 d，在修正條件下，實際測得吸光度(均值)為0.612 7，回歸模型預測吸光度理論值為0.612 2。實際測定值比理論預測值高0.000 5。

再對其進行吸光度測定，繪制標準曲線和曲線方程，觀察其符合程度和精確度，見圖9。

圖9 優(yōu)化后DNS配方吸光度測定結果的曲線繪制及曲線方程

由圖9可知，其曲線非常理想，R2達到了0.999 9，是符合要求的，且其精密度是相當高的，因此優(yōu)化后效果顯著。

2.5 淀粉回收率試驗

為檢驗新DNS配方的準確性，特作了回收率試驗。先測純淀粉回收率。方法是稱取0.5 g純淀粉，用鹽酸水解，新DNS配方比色法測定。結果純淀粉5次測定的回收率分別為 101.24%、100.41%、100.62%、100.53%，100.41%，平均為100.64%，標準偏差為0.12%。說明純淀粉回收率符合測定要求。

為測定甘薯加純淀粉回收率，先稱取0.25 g甘薯及0.25 g純淀粉，混合后用鹽酸水解－DNS比色法測定。表6結果表明，鹽酸水解－DNS比色法測定淀粉回收率97.66%～101.42%，符合甘薯中淀粉測定所要求的準確度。

表6 甘薯加淀粉回收率

2.6 新DNS配方對甘薯測定結果

用新DNS配方和標準DNS配方對20種甘薯中淀粉含量進行測定和比較，測定結果見表7。

由20個品種測定結果可得:新配方比標準配方測定的結果平均高約2%，說明新配方測定甘薯中淀粉的含量是符合要求的。

表7 20個甘薯品種測定結果/%

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過Box－Benhnken中心組合響應面分析法，結合淀粉回收試驗和20個甘薯品種實際測定結果，確定優(yōu)化后的最佳DNS配方為:稱取9.165 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后加入10%氫氧化鈉溶液426 mL，再加入20 mL丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL，貯于棕色試劑瓶中放置7 d后使用。按照此配方制作標準曲線非常理想，其R2達到了0.999 9，符合要求，且實際測定結果，新配方比標配方測定的結果平均高約2%，也是符合要求的。

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