慢病毒Tet-On系統(tǒng)調控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12細胞中表達的研究*

劉永敏，段 萍，黃春田，李 博，韓雪飛，許 燕，鄢文海，邢 瑩，4△

（1.鄭州大學干細胞研究中心，2.病理生理學教研室，3.生理學教研室，河南鄭州450001；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學教研室，河南新鄉(xiāng)453003）

Notch信號是一個在進化過程中高度保守的信號通路，Notch基因在許多組織細胞中都有表達，包括中樞神經系統(tǒng)、胰腺、造血細胞等，它編碼一種跨膜受體蛋白，參與調節(jié)各種細胞分化及發(fā)育的信號轉導途徑［1-3］。Notch信號通路的失調與多種神經系統(tǒng)腫瘤形成密切相關。

在體內Notch信號通路始終處于一個動態(tài)調控過程中，因此建立一個可調控的研究體系有利于研究Notch信號通路在不同時間點的作用差異。在可調控的真核生物基因表達系統(tǒng)中，四環(huán)素調控系統(tǒng)被認為是目前最為理想的選擇，該系統(tǒng)具有嚴密性、特異性、高效性、低毒性等優(yōu)點，被廣泛地應用到生物醫(yī)學研究中。

在本研究中我們構建Tet-on調控的攜帶增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的人源性 Notch1胞內段（Notch1 intracellular domain，NICD）融合蛋白的慢病毒真核表達載體，并探討四環(huán)素基因表達系統(tǒng)調控Notch1-EGFP在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系（PC12細胞）細胞中表達的時間和濃度的量效關系，為研究Notch信號通路的作用提供一條更靈活更科學的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體胎盤組織 正常人胎盤組織取自河南省人民醫(yī)院，根據(jù)國務院《醫(yī)療機構管理條例》規(guī)定，患者簽寫知情同意書，符合倫理學標準。

1.1.2 試劑 大腸桿菌 JM109、pEGFP-C1質粒、pcDNA 3.1（＋）載體、PC12細胞為本實驗室常規(guī)保存、pLVX-Tight-Puro載體，pLVX-Tet-On Advanced及Lenti-XTMHTX Packaging System載體購自ClonTech公司，總RNA提取試劑盒（Trizol）購自北京天根公司，cDNA第一鏈試劑盒購自formatas公司，限制性內切酶 BamH I、EcoR I、Nhe I、Xba I、T4連接酶、DNA Marker（1kb，DL2000，DL1000）、PCR premix購 自Takara公司，DNA凝膠回收試劑盒、高純度質粒抽提試劑盒購自Axygen公司，胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID公司（英國），瓊脂粉購自 Genehk公司，G418購自 Genview公司，嘌呤霉素購自 Solabio公司，流式破膜固定試劑盒、PE Mouse Anti-Mouse Notch1購自BD公司，鹽酸強力霉素購自上?？笊镉邢薰?。

1.2 pcDNA3.1-Notch1真核表達載體的構建

根據(jù) Notch1（NM-017617.3）的功能編碼區(qū)序列和pcDNA3.1（＋）載體的多克隆位點，選擇BamHI和XbaI酶切位點作為酶切位點設計引物，引物由上海生物工程有限公司合成Notch1-F：5＇CGCGGATCCATGCGCAAGCGCCGGCGGCAGCAT3＇；Notch1-R：5＇ACGTCTAGACACGTCTGCCTGGCTCGG3＇，下劃線部分分別表示BamHI和XbaI的酶切位點。參照總RNA提取試劑盒（Trizol）說明抽提人胎盤組織的總RNA，用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒反轉錄cDNA第一鏈，PCR擴增Notch1胞內段（NICD）cDNA。PCR反應體系總體積 50μl，其中含模板 cDNA 2μl，2×Premix 25μl，Notch1-F 1μl，Notch1-R 1μl，滅菌雙蒸水21μl。PCR反應條件：94℃，預變性 5 min；進入循環(huán)：94℃1min，60℃ 90 s，72℃ 90 s，共 30個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增反應結束后PCR終產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用無水乙醇純化PCR產物。將帶有酶切位點PCR產物用BamH I和XbaI進行雙酶切，回收目的基因片段，將 pcDNA3.1（＋）載體進行相應的酶切，回收線性化載體。將載體與目的基因按摩爾比1∶5連接過夜，將上述連接產物轉化感受態(tài)菌 JM109，涂板，，挑選陽性克隆進行 BamH I和XbaI雙酶切鑒定并送上海生物公司測序。鑒定正確的克隆命名為pcDNA3.1-Notch1。

1.3 pcDNA3.1-Notch1-EGFP載體的構建

以pEGFP-C1為模板進行PCR擴增EGFP基因，擴增產物為744 bp。EGFP擴增引物為：EGFP-F：5＇GGGCCCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3＇；EGFP-R：5＇GGGCCCGCTAGCGAATTCTTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT 3＇，下劃線部分分別為 XbaI、NheI和EcoRI的酶切位點，EcoRI為引入的驗證酶切位點。PCR反應體系40μl，其中含模板質粒 pEGFP-C1 2 μl，Premix 20μl，EGFP-F 1μl，EGFP-R 1μl，滅菌雙蒸水16μl。PCR反應條件：94℃，預變性5min；進入三溫循環(huán)：94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 30 s，共 30個循環(huán)；72℃延伸10min。將純化后的PCR產物經XbaI和NheI雙酶切產生兩個同尾粘末端，回收目的片段。以XbaI酶切 pcDNA3.1-Notch1，DNA凝膠電泳回收載體片段。T4 DNA連接酶連接上述EGFP和線性化pcDNA3.1-Notch1。連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109細胞，涂板，過夜培養(yǎng)。挑單克隆做菌落PCR，挑選EGFP擴增陽性克隆進一步提取質粒，用EcoR I和BamH I雙酶切，DNA凝膠電泳，根據(jù)酶切后片段長度判段EGFP的連接方向。鑒定正向連接的克隆命名為pcDNA3.1-Notch1-EGFP。

1.4 pLVX-Notch1-EGFP載體的構建

用EcoR I和 BamH I雙酶切 pcDNA3.1-Notch1-EGFP，DNA凝膠電泳并膠回收Notch1-GFP片段。用EcoR I和BamH I雙酶切pLVX-Tight-Puro載體，DNA凝膠電泳并膠回收線性化載體。將線性化的pLVXTight-Puro載體和Notch1-EGFP片段用T4連接酶連接，連接產物轉化感受態(tài)JM109后涂板培養(yǎng)。挑單克隆做菌落PCR，挑選EGFP擴增陽性克隆送生物公司測序。測序正確的載體命名為pLVX-Notch1-EGFP。

1.5 慢病毒包裝

包裝前24 h，分別接種4～5×106個293T細胞到2個100mm培養(yǎng)皿中。按照慢病毒包裝試劑盒（Lenti-XTMHTX Packaging System，Clontech）說明書，分別包裝 Tet-On調控系統(tǒng)的反應質粒（pLVX-Tight-Puro-NICD-EGFP）和調控質粒（pLVX-Tet-On Advanced），準備兩個 1.5 ml的 EP管 A、B，A管加入557μl的 Xfect Reation Buffer，36μl Lenti-X HTX Packaging Mix，7μg的目的質粒，B管加入592.5μl Xfect Reaction和 7.5μl Xfect polymer，渦旋混勻，將 B管的試劑逐滴加入A管中，渦旋混勻，室溫孵育10 min，將A管液體逐滴加到293T細胞中，輕輕晃動培養(yǎng)皿使之混勻，放入培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2孵育8 h后換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)36 h收獲病毒上清，500×g離心10 min去除細胞碎片。病毒上清可馬上用于感染，或分裝置于-80℃保存。

1.6 慢病毒感染PC12及抗性篩選

感染前24 h接種2×105cells／well的 PC12細胞于六孔板，病毒感染時細胞50%～70%融合。按照1∶1的比例每孔各加pLVX-Tight-Puro-NICD-EGFP和pLVX-Tet-On Advanced病毒上清400μl，并各加入終濃度為4μg／ml的 polybrene。感染 8～12 h后，吸出原培養(yǎng)基，換為終濃度為 600μg／ml G418和 1.5μg／ml嘌呤霉素培養(yǎng)基進行篩選。之后每3天更換一次抗性培養(yǎng)基，連續(xù)篩選14 d，命名該細胞為PC12-Notch1細胞。

1.7 Dox調控Notch1-EGFP的表達

接種1×104cells／well的 PC12-Notch1細胞于24孔板，分為 Dox（＋）組和 Dox（-）組，每組設 5個平行樣，在Dox（＋）組培養(yǎng)基中加入終濃度為500μg／ml Dox，Dox（-）組不加 Dox。觀察熒光前進行 DAPI核染色，在培養(yǎng)基中加入 DAPI（終濃度為 50 g／ml），37℃、5%CO2孵育2 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。分別在 Dox加入后的 0 h、12 h、24 h、36 h和 48 h于熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP表達和DAPI核染色，計算EGFP陽性細胞百分比（EGFP陽性細胞數(shù)／DAPI陽性細胞數(shù)×100%）。

1.8 流式細胞術檢測Notch1表達

1.8.1 檢測Dox誘導下不同時間點的Notch1表達接種1×104cells／well的 PC12-Notch1細胞于 24孔板，共5組，每組三個平行樣，均加入終濃度為500 ng／ml Dox，分別在加入 Dox后的 0 h、12 h、24 h、36 h和48 h收集細胞，按照流式破膜固定試劑盒的步驟處理，上機檢測Notch1的表達量及表達Notch1的陽性細胞百分比。獨立實驗重復三次。

1.8.2 檢測不同Dox濃度誘導下的Notch1表達接種1×104cells／well的 PC12-Notch1細胞于 24孔板，分別用不同濃度Dox誘導，終濃度分別為0 ng／ml、100 ng／ml、500 ng／ml、1μg／ml、5μg／ml和 10μg／ml。每個濃度設三個平行樣。誘導36 h后收集細胞，按照流式破膜固定試劑盒的步驟處理 PC12-Notch1細胞，上機檢測 Notch1的表達量及表達Notch1的陽性細胞百分比。獨立實驗重復三次。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計處理用SPSS 13.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-Notch1載體的鑒定

對重組質粒 pcDNA3.1-Notch1進行 BamHI和XbaI雙酶切并進行DNA凝膠電泳，結果顯示重組質粒經雙酶切后，產生約5.4 kb的 pcDNA3.1（＋）載體片段和約2.1kb的Notch1片段（圖1）。送測序結果與 Notch1（GenBank：NM-017617.3）序列一致。

Fig.1 pcDNA3.1-Notch1 was digested with BamHIand XbaI

2.2 pcDNA3.1-Notch1-EGFP載體的鑒定

用EcoR I和 BamH I雙酶切 pcDNA3.1-Notch1-EGFP，酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳（圖2）。酶切產物為 2.8 kb（Notch1＋EGFP）和 5.4 kb（pcDNA3.1）兩個片段的克隆為正向連接克?。幻盖挟a物為 2.1 kb（Notch1）和 6.1 kb（pcDNA3.1＋EGFP）兩個片段的克隆為反向連接克隆。

2.3 pLVX-Notch1-EGFP載體的鑒定

將pLVX-Notch1-EGFP質粒進行EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳（圖3）。結果證實Notch1-GFP與pLVX-tight-puro載體連接成功。酶切鑒定正確的克隆送公司測序，測序結果與 Notch1（GeneBank：NM-017617.3）序列一致。

Fig.2 pcDNA3.1-Notch1-EGFP was digested with EcoR I and BamH I

Fig.3 pLVX-Notch1-EGFPwas digested with EcoR Iand BamH I M：DNA Marker；1：Products of pLVX-tight-puro vector by EcoR Iand BamH I digestion；2：Products of pLVX-Notch1-EGFP by EcoR Iand BamH I digestion，which produces 7.2 kb and 2.8 kb fragments

2.4 穩(wěn)定表達pLVX-Notch1-EGFP的 PC12-Notch1細胞株建立

抗性篩選2周后，在細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為 500 ng／ml的 Dox誘導 36 h，Dox（-）對照組無 EGFP表達，Dox（＋）組中有EGFP表達。DAPI核染色后計算EGFP陽性細胞百分比，EGFP陽性細胞數(shù)大于為90.2%。從圖 Merged（DOX＋）可以看出，綠色熒光蛋白表達主要集中在細胞核（圖4）。

Fig.4 PC12-Notch1 cells under inverted fluorescencemicroscope（×200）

2.5 流式細胞術檢測Dox不同誘導時間和不同濃度誘導下Notch1表達

流式細胞術檢測 Notch1陽性細胞百分比。Notch1在PC12-Notch1細胞和PC12細胞空白對照組中均維持低表達，Notch1陽性細胞百分比分別為6.1%和 7.2%（P＞0.05）。PC12-Notch1細胞經過500 ng／ml的 Dox誘導不同時間（0、12 h、24 h、36 h、48 h）后，Notch1陽性細胞百分比分別為 6.1%、59.7%、66.2%、81.5%、65.5%（圖 5A），36 h達到外源性蛋白表達高峰。PC12-Notch1細胞經過不同濃度 Dox（100 ng／ml、500 ng／ml、1μg／ml、5μg／ml、10 μg／ml）誘導 36 h后，Notch1陽性細胞百分比分別為77.4%、81.5%、86.9%、94.8%和 98%（圖 5B）。Dox濃度在 10μg／ml及 10μg／ml以下時，細胞均能良好增殖并維持正常細胞形態(tài)，顯示Dox無明顯毒性作用。

3 討論

Notch信號系統(tǒng)最初是在果蠅的神經系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)的。迄今為止在脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)4個Notch的同源體，包括 Notchl、Notch2、Notch3和 Notch4（int3）。Notch1受體屬于I型膜蛋白，它在不同物種之間（從果蠅到人）以及同一物種的不同成員之間都有高度的結構同源性。人Notchl由胞外亞基（Notch extracellular subunit，NEC）和跨膜亞基（Notch transmembrane subunit，NTM）組成，兩個亞基之間通過Ca2＋依賴的非共價鍵結合在一起形成異源二聚體。Notch信號通路的激活需要經過三步酶切過程，在高爾基復合體內被furin樣蛋白酶在其S1位點酶切為兩條多肽鏈，即NEC和NTM。配體與Notch1受體結合后促使NEC與NTM發(fā)生解離，同時激活后續(xù)的S2和S3位點的酶切事件，從而釋放了Notch1受體的激活形式（Notch intracellular domain，NICD），轉位入細胞核發(fā)生核內應答。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)當Dox誘導Notch1（NICD）-EGFP融合蛋白在PC12細胞中表達時，綠色熒光主要集中在細胞核，表明該融合蛋白也可轉位入細胞核，從而在核內發(fā)揮其調控作用。

Fig.5 Time and dose dependency between Dox induction and Notch1 expression detected by flow cytometry in PC12-Notch1 cells

本實驗采用慢病毒介導的外源性基因表達系統(tǒng)，相對于脂質體等轉染方法而言，該系統(tǒng)對于多數(shù)細胞均有較高的轉染效率。在PC12細胞中，慢病毒感染后再經過抗性篩選，成功獲得穩(wěn)定表達外源性基因Notch1的PC12-Notch1細胞系。該細胞系可以穩(wěn)定傳代并凍存、復蘇，為研究Notch1基因在神經細胞的功能提供了良好模型。

PC12-Notch1細胞中Notch1表達受到Dox調控。該調控方式采用Tet-on基因調控系統(tǒng)，該系統(tǒng)由大腸桿菌Tn10轉座子中四環(huán)素阻遏操縱子的兩個部件四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）和四環(huán)素操縱子序列（TetO）與四環(huán)素（Tet）及其衍生物（Dox）組成。在沒有四環(huán)素的情況下，rtTA不能識別TetO，所以外源性基因表達水平為零；而在加入四環(huán)素衍生物Dox后，rtTA構像改變，可以與TetO特異的結合，啟動下游目的基因表達，并且呈劑量依賴性。本研究在慢病毒介導的Tet-on系統(tǒng)的應答質粒中插入攜帶Notch1-EGFP融合蛋白，慢病毒包裝后感染PC12細胞，建立了PC12-Notch1細胞系。結果發(fā)現(xiàn)在PC12-Notch1細胞系中Notch1陽性細胞百分比維持在較低水平，與沒有病毒感染的PC12細胞中的Notch水平無明顯差異，顯示在沒有Dox的培養(yǎng)環(huán)境里，外源性基因的轉入不會引起PC12細胞Notch表達水平的改變。按照 Clontech公司推薦 Dox誘導濃度（500 ng／ml）誘導 PC12-Notch1細胞，發(fā)現(xiàn) Dox作用 12 h后就能檢測到Notch1表達顯著增高，隨著誘導時間延長，Notch1表達逐步增高并在36 h達到頂峰，之后Notch1陽性細胞略有下調，但仍然顯著高于Dox調控前。我們進一步研究了不同Dox濃度對Notch1表達的誘導效率，采用的檢測時間點是高峰點，即誘導后36 h，結果顯示隨著Dox濃度增加，Notch1陽性細胞百分比顯著增加。在低濃度100 ng／ml Dox作用下，Notch1陽性細胞百分比達到77.4%；之后從100 ng／ml到 10μg／ml Dox濃度，Notch1陽性細胞百分比隨著Dox濃度增加而上升的速度變緩。雖然本實驗中EGFP和Notch1是融合蛋白并同時在細胞內表達，但在500 ng／ml Dox作用36 h時，EGFP陽性細胞百分比為90.2%（熒光顯微鏡下計數(shù)），顯著高于Notch1陽性細胞百分比（流式細胞術檢測，81.5%）。由于上述差異可能是流式細胞術檢測的敏感性低于綠色熒光計數(shù)方法造成，我們認為500 ng／ml Dox可以較好啟動Notch1-EGFP融合蛋白的表達，同時該濃度Dox仍在安全無毒范圍內，適用于體外誘導實驗。

綜上所述，本研究成功構建了攜帶人源性Notch1-EGFP融合蛋白的可調控的慢病毒真核表達載體，建立四環(huán)素調控的PC12-Notch1細胞系，并闡明體外調控Notch1在PC12-Notch1細胞中表達的最佳Dox濃度和調控時間。

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