ATP敏感性鉀通道開放劑埃他卡林逆轉(zhuǎn)心室重構及其內(nèi)皮細胞機制*

鐘明利，汪 匯，周紅敏，張雁芳，崔文玉，龍超良，段 煉，汪 海，4△

（1.廣西醫(yī)科大學，南寧530021；2.軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所心血管藥物研究中心，北京100850；3.軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院，北京100071；4.北京賽德維康醫(yī)藥研究院，北京100039）

心力衰竭作為各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，其發(fā)病率、死亡率非常高，5年存活率甚至與惡性腫瘤相仿。研究表明，心室重構是心臟對各種血流動力學超負荷和神經(jīng)內(nèi)分泌（如 NE、ET-1、PGI2等）的一種長期適應性過程，如果該損傷因素持續(xù)存在，最終將導致心衰的發(fā)生，因此心室重構是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎，阻斷心室重構是預防心力衰竭的一個重要環(huán)節(jié)［1］。

近年來，內(nèi)皮細胞在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中越來越受到重視。靶向激活內(nèi)皮細胞ATP敏感性鉀通道（KATP），糾正內(nèi)皮功能紊亂是治療心血管疾病的重要策略［2］。新型KATP開放劑埃他卡林是一種全新抗高血壓藥物，它能夠通過選擇性激活SUR2B／Kir6.1亞型 KATP糾正內(nèi)皮功能紊亂，從而使失衡的一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）系統(tǒng)以及前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）恢復平衡［3］。本室前期試驗表明，埃他卡林（iptakalim，Ipt）能通過保護內(nèi)皮功能逆轉(zhuǎn)壓力超負荷所致的心室重構和自發(fā)性高血壓大鼠心血管重構［4，5］，減輕肺動脈高壓引起的右心室重構［6］，但對于通過異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導的心室重構是否有保護作用尚未研究。因此，本實驗采用ISO誘導致大鼠心室重構，探討Ipt逆轉(zhuǎn)心室重構的作用及其內(nèi)皮細胞機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及儀器

1.2 動物模型制備和分組

雄性Wistar大鼠30只，體重180～220 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。大鼠隨機分為3組（n＝10）：空白對照組、ISO組（模型組）、Ipt（3 mg／kg）組。根據(jù)文獻略加改進制備大鼠心室重構模型［7］：模型組和Ipt組均連續(xù)7 d多點皮下注射異丙腎上腺素85 mg／（kg·d），空白對照組皮下注射等量的生理鹽水，并同時開始灌胃給藥 Ipt3 mg／（kg·d），給藥容積為2 ml／kg，連續(xù)給藥6周，空白對照組和模型組給予等體積的蒸餾水。

1.3 血流動力學檢測

大鼠給藥6周后，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（45mg／kg），分離右頸總動脈，將充滿肝素的聚乙烯導管插入右頸總動脈，經(jīng)壓力換能器連接RM-6000八導生理記錄儀，穩(wěn)定10min，記錄頸總動脈收縮和舒張壓，而后順著頸動脈向心方向?qū)Ч茌p輕插入4～4.5 cm，穩(wěn)定后用SMUP-PC生物信號分析系統(tǒng)記錄不同時間點左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末期壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力最大上升速率和左室壓力最大下降速率（±dp／dtmax）、心肌纖維縮短速率的生理最大值（Vpm）、心肌纖維縮短速率的理論最大值（Vmax），計算平均值。

1.4 心臟重量指數(shù)測定

記錄血流動力學參數(shù)后，迅速開胸取出心臟，用預冷的0.9%生理鹽水洗凈血跡，濾紙吸干，沿房室溝剪掉心耳和心室周圍結(jié)締組織，用電子天平稱取全心重量（heartweight，HW），然后緊貼室間隔右側(cè)分離剪下稱量左心室（包括室間隔）重量（left ventricular weight，LVW）和右心室重量（right ventricular weight，RVW），分別計算全心指數(shù)（heart weight／body weight，HW／BW）、左心指數(shù)（LVW／BW）、右心指數(shù)（RVW／BW）。

1.5 病理學指標檢測

心肌組織用10%中性福爾馬林固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，進行石蠟切片（5μm），蘇木精一伊紅（HE）染色和Masson’s三色染色。切片在Leica DFC295型顯微鏡下觀察并攝片，心肌細胞的橫截面積用NIH Image 1.61軟件（National Institutes of Health Service Branch）計算。分析部位為心臟左心室（心內(nèi)膜），每只動物隨機選取100個細胞（HE染色，×400）。Masson’s三色染色（×200）采用 Image-pro plus 6.0圖像分析軟件分析心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.6 左心室心肌組織中羥脯氨酸含量的測定

羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量測定采用堿水解法，取50 mg左心室組織，制備組織勻漿液，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，并在550 nm處測量心肌組織中Hyp的含量。

1.7 放免法測定血漿中ET-1和PGI2含量

記錄血流動力學參數(shù)后取血，測ET-1的血樣預先加入7.5%EDTA二鈉15μl和抑肽酶20μl于試管中；測 PGI2的血樣預先加入消炎痛-EDTA二鈉100μl于試管中，4℃離心 3 500 r／min，離心 15 min，各取上清100μl，于-70℃冰箱保存。放射免疫法測定血漿中ET-1和PGI2，試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供，嚴格按照說明書操作。

1.8 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行，組間比較采用t檢驗。

總體而言，現(xiàn)實的情況是為最大限度的優(yōu)化住院醫(yī)師培訓，陪練式現(xiàn)場督導教育實踐模式在短期內(nèi)可能仍然需要結(jié)合傳統(tǒng)帶教模式，由帶教老師對其進行兒童保健相關專業(yè)知識總培訓，然后再進行陪練式現(xiàn)場督導教育實踐，增加練兵的機會。

2 結(jié)果

2.1 Ipt對ISO致大鼠心室重構血流動力學的影響

與空白對照組相比，模型組中平均動脈壓（MABP）、反映心臟功能的參數(shù)包括 LVSP，±dp／dt-max，Vpm，Vmax均顯著降低，相反，其 LVEDP顯著升高（P＜0.01，表1）。而Ipt治療6周后，大鼠的平均動脈壓、心臟的舒縮功能均顯著改善（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Effect of Ipt on MABP and hemodynamic parameters on isoproterenol-induced cardiac remodeling in rats（±s，n＝10）

Tab.1 Effect of Ipt on MABP and hemodynamic parameters on isoproterenol-induced cardiac remodeling in rats（±s，n＝10）

MABP：Mean artery blood pressure；LVSP：Left ventricular systolic pressure；＋dp／dtmax：Maximal rate of left ventricular systolic pressure；Vpm：Physiological velocity of contractile element shorting；Vmax：Maximal velocity of contractile elementshorting；LVEDP：Left ventricular end-diastolic pressure；-dp／dtmax：Maximal rate of left ventricular diastolic pressure；Ipt：Iptakalim*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs model group

Group MABP（mmHg） LVSP（kPa） ＋dp／dtmax（kPa／s） -dp／dtmax（kPa／s） Vpm（s） Vmax（s） LVEDP（kPa ）Control 109.9±4.2 20.29±0.44 462.8±24.6 444.4±34.51 0.97±0.08 0.73±0.14 5.97±0.55 Model 94.9±9.0**19.36±0.37**375.1±30.8** 342.7±31.42** 0.72±0.08**0.24±0.11**7.46±0.53**Ipt3mg／kg 108.3±4.5＃＃ 19.82±0.64*＃＃441.4±19.2*＃＃ 415.0±36.17*＃＃ 0.95±0.05＃＃ 0.67±0.12＃＃ 5.88±0.37＃＃

2.2 Ipt對ISO致大鼠心室重構的影響

2.2.1 Ipt對ISO致大鼠心室重構模型的心臟重量指數(shù)的影響 ISO連續(xù)皮下注射7 d可引起大鼠HW／BW、LVW／BW和RVW／BW等指數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，表 2），Ipt 3 mg／kg組能明顯抑制心臟重量指數(shù)的增高（P＜0.05，P＜0.01，表 2），提示 Ipt能明顯抑制 ISO致大鼠心臟重量指數(shù)的增加。

Tab.2 Effects of Ipt on heart weight index on isoproterenol-induced cardiac remodeling in rats（±s，n＝10）

Tab.2 Effects of Ipt on heart weight index on isoproterenol-induced cardiac remodeling in rats（±s，n＝10）

HW：Heart weight；LVW：Left ventricular weight；RVW：Right ventricular weight；BW：Body weight；Ipt：Iptakalim*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group HW／BW LVW／BW RVW／BW Control 2.38±0.12 1.90±0.10 0.48±0.07 Model 2.63±0.12**2.08±0.11**0.55±0.07*Ipt3mg／kg 2.41±0.12＃＃ 1.95±0.11＃＃ 0.46±0.05＃

2.2.2 Ipt對ISO致大鼠心室重構模型的心肌組織病理形態(tài)學的影響 與空白對照組相比，模型組心肌纖維增粗紊亂，炎性細胞浸潤，心肌細胞橫截面積明顯增加。經(jīng)Ipt 3 mg／kg治療6周后，可明顯改善心肌的病理變化、抑制心肌細胞肥大（圖1見彩圖頁Ⅲ）。

A：Figure of myocyte cross-section（HE ×400，×200）；B：Statistic results of myocyte cross-sectional area；Ipt：Iptakalim*P <0.05，**P < 0.01 vs control group；##P <0.01 vs model group

2.2.3 Ipt對ISO致大鼠心室重構模型的心肌纖維化的影響 由于羥脯氨酸在膠原蛋白中所占的比例比較恒定，所以心肌組織內(nèi)羥脯氨酸的濃度可代表膠原的水平，即心肌纖維化的病變程度。Masson’s染色中肌纖維、纖維素呈紅色，膠原纖維呈綠色，綠色增多表明心肌纖維化程度加重。與空白對照組相比，模型組中心肌組織CVF和心肌組織中羥脯氨酸含量明顯增加（71.52%，P＜0.01），Ipt能明顯抑制心肌組織中羥脯氨酸含量的增加 35.5% （P＜0.05），減輕心肌纖維化的病變程度（圖2見彩圖頁Ⅲ）。

Fig. 2 Effects of Ipt on myocardial fibrosis and hydroxyproline content in cardiac tissue in ISO treated rats（x ± s, n = 10）

2.3 Ipt對血漿中ET-1和PGI2含量的影響

與空白對照組相比，模型組血漿中的ET-1含量增加，PGI2含量明顯降低，經(jīng) Ipt 3 mg／kg治療6周后，可顯著降低血漿中 ET-1的含量，增加血漿中PGI2的含量（P＜0.05，P＜0.01，表 3）。

Tab.3 Effects of Ipton plasma contents of ET-1 and PGI2 in ISO treated rats（±s，n＝10）

Tab.3 Effects of Ipton plasma contents of ET-1 and PGI2 in ISO treated rats（±s，n＝10）

Ipt：Iptakalim；ET-1：Endothelin-1；PGI2：Prostacyclin*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group ET-1（pg／ml） PGI2（pg／ml）Control 91.9±25.4 305.7±54.4 Model 159.2±33.7** 248.1±70.7*Ipt3mg／kg 91.9±25.7＃＃ 328.6±108.7＃

3 討論

心室重構為心臟損傷后出現(xiàn)的基因表達、分子、細胞和間質(zhì)改變，臨床上主要表現(xiàn)為心功能改變、心肌肥厚和心肌纖維化等。異丙腎上腺素屬于β受體激動劑，連續(xù)皮下注射能夠激活大鼠腎素-血管緊張素系統(tǒng)，通過加快心率、增加心肌收縮力和心肌耗氧量，同時產(chǎn)生大量的兒茶酚胺可造成心肌彌漫性壞死和纖維化。心肌肥厚過程中心肌相對供血供氧不足，加重了心肌缺血、缺氧。本實驗大鼠連續(xù)皮下注射ISO后，心臟重量指數(shù)、心肌細胞肥大和心肌組織纖維化程度均明顯增加，收縮和舒張功能明顯減弱，與空白對照組相比差異具有顯著性（P＜0.01），表明該實驗成功地復制了心室重構模型。

本實驗結(jié)果表明Ipt給藥6周后，能夠明顯抑制心臟指數(shù)的增加、減輕心肌細胞的肥大、減弱心肌細胞的纖維化程度、降低心肌組織中羥脯氨酸的含量、改善心臟收縮和舒張功能、恢復降低的平均動脈壓，表明埃他卡林對ISO致大鼠心室重構具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。

血管內(nèi)皮細胞是分布在心血管系統(tǒng)內(nèi)壁的一層單細胞層，具有影響心血管系統(tǒng)功能的重要作用。在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞合成分泌多種血管活性物質(zhì)，如 NO、ET-1、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、PGI2等，調(diào)節(jié)血管緊張性并維持正常血壓，以及對改善高血壓和心室重構發(fā)揮重要作用。其中，ET-1是一種很強的縮血管物質(zhì)，在正常心血管系統(tǒng)中不發(fā)揮重要作用；但在心衰等病理條件下，ET-1在調(diào)節(jié)外周血流動力學參數(shù)變化、左心室功能和心室重構等方面發(fā)揮重要作用［8］。在主動脈縮窄、肺動脈高壓模型和慢性心臟功能衰竭模型以及心室重構中 ET-1的表達顯著增加［4，6］。PGI2是心血管系統(tǒng)中一種主要的前列腺素，其生理意義在于舒張血管和防止血小板聚集；其受體 IP（prostacyclin receptor，IP）在心血管系統(tǒng)中均有表達，Hara等發(fā)現(xiàn)敲除 IP基因的小鼠［9］，在縮窄主動脈后，心臟發(fā)生了明顯的重構，而重構程度比縮窄主動脈的野生型小鼠明顯增高；同時研究發(fā)現(xiàn)，PGI2在體外可以抑制AngⅡ誘導的培養(yǎng)心肌細胞肥大和心肌成纖維細胞分泌膠原［10］。這些研究表明，PGI2在抑制心室重構和心肌肥大的病理過程中發(fā)揮著重要作用。

本室的大量研究表明，新型KATP通道開放劑Ipt具有明確的抗心血管重構的作用，能夠通過激活內(nèi)皮細胞KATP通道，促進NO和 PGI2分泌，抑制 ET-1的分泌，糾正內(nèi)皮細胞功能紊亂，從而逆轉(zhuǎn)壓力超負所致的心室重構［4］。本實驗在ISO致大鼠心室重構中的結(jié)果表明，經(jīng)過Ipt給藥6周后，與模型組相比，血漿中ET-1含量明顯降低，PGI2含量明顯升高，在對抗心室重構的過程中可能發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，埃他卡林能明顯逆轉(zhuǎn)ISO所致的心室重構，其機制與糾正內(nèi)皮功能紊亂，調(diào)節(jié)ET-1和PGI2系統(tǒng)的功能平衡相關。

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