內質網應激與病毒性肝炎

楊丙章，任 鋒，段鐘平，師水生

1.山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，山西 太原 030001;2.北京市肝病研究所;3.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是哺乳細胞中一種重要的亞細胞器，是分泌性蛋白合成與折疊、蛋白質糖基化修飾、蛋白質分泌的場所，同時也是貯存和釋放鈣離子的場所。在生理或病理條件下，如分泌蛋白的翻譯增加、折疊和蛋白酶體降解能力下降、氧化還原狀態(tài)和鈣離子水平的改變、ATP的耗竭以及錯誤的翻譯后修飾都會干擾ER的穩(wěn)態(tài)，將會造成未折疊蛋白在內質網內的聚集，影響內質網的正常功能，稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1-2]。大量的研究證明，內質網應激能夠誘導細胞凋亡，而最新的研究表明內質網應激還能夠誘導炎癥反應，并且影響著炎癥性疾病的進展。本文就內質網應激與炎癥反應的關系，以及其在病毒性乙型肝炎和丙型肝炎致病機制中作用的最新研究進展作一綜述。

1 未折疊蛋白反應及其信號通路

1.1 未折疊蛋白反應 為了確保蛋白折疊的正確性以及預防非折疊或錯誤折疊蛋白在細胞內的聚集，抵抗內質網應激的不利作用，細胞呈現(xiàn)出保護性的未折疊蛋白反應(unfold protein response，UPR)，其改變細胞的轉錄和翻譯程序以緩解內質網應激，因此一定程度的ERS能激活細胞保護機制[3]。但嚴重的或長時間的應激損傷內質網的功能時，則引發(fā)細胞內的凋亡，細胞死亡程序最終誘導細胞凋亡[4]。位于內質網的幾種跨膜蛋白保持著內質網的穩(wěn)態(tài)，監(jiān)測著蛋白的折疊情況以及內質網腔結構域細胞膜的完整性，這些感應蛋白分別是Ⅰ型ER跨膜蛋白激酶(type-1 ER transmembrane protein kinase，IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR)-like ER kinase，PERK)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。通常情況下，這幾個蛋白與內質網腔內的伴侶蛋白結合而保持著被抑制的非活性狀態(tài)，尤其是葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein-78，GRP78)。在 UPR期間，GRP78從與IRE1α、ATF6和PERK的結合中分離，去結合未折疊蛋白處理其暴露的疏水區(qū)域，通過ATP水解所引起的ATP酶結構域構象變化來促進蛋白的正確折疊。GRP78脫離后釋放出的 IRE1α、PERK和ATF6反而引發(fā)UPR:IRE1α和PERK通過二聚化和/或自體磷酸化而自身激活，ATF6轉移到高爾基體中，通過調節(jié)性膜內蛋白水解過程而被激活[5]，它們激活后促進UPR的發(fā)生。

1.2 未折疊蛋白反應信號通路及其功能 IRE1α-XBP-1信號通過提高折疊蛋白的能力并減少蛋白生成負荷來提高蛋白折疊能力，減少未折疊蛋白。IRE1α被激活后呈現(xiàn)出核酶功能，剪切X盒結合蛋白1(XBP-1)mRNA，由此產生的sXBP-1通過控制ER相關降解(ER-associated degradation，ERAD)的基因啟動子UPR元件而激活轉錄，提高折疊蛋白能力[6]。IRE1α作為核酶活性的另外一種功能是降解編碼分泌性的mRNA(例如胰島素mRNA)和膜蛋白基因，以減少新合成的、需要被折疊的蛋白質[7]。

ATF6信號通路通過調節(jié)UPR的轉錄以提高蛋白的折疊能力。研究發(fā)現(xiàn)，ATF6是一個UPR的共同激活子，可以結合幾乎UPR反應基因啟動子的所有元件，ATF6影響了大約 10% ～20%的 UPR調節(jié)基因[8]。經過一定的膜內蛋白水解的調節(jié)，ATF6轉移到細胞核內，與內質網應激反應元件相互作用，上調伴侶蛋白/折疊酶，如 GRP78、GRP94、IRE1α、蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)、ERp72、GRP58/ERp57、calnexin 和鈣網蛋白等，這些蛋白都增加了內質網中的蛋白折疊能力[9]。

PERK-eIF2a信號通路減少了蛋白mRNA的翻譯。激活的PERK使真核翻譯起始因子2α亞基(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，從而關閉蛋白質的翻譯，阻止蛋白質負荷增加，同時選擇性地增加某些mRNA的翻譯水平，例如ATF4，從而促進伴侶蛋白的上調[10]。此外，最近的研究表明，UPR通過誘導自噬，可能通過早期c-Jun氨基末端激酶(JNK)的激活或TOR-ATG信號通路，快速去除多余的或者受損的細胞器和細胞質成分從而保護應激細胞[11]。

綜上所述，當內質網環(huán)境受到干擾，分泌蛋白或者膜蛋白積聚于內質網內，內質網應激分別通過激活IRE1α、PERK和ATF6信號通路，減少新生蛋白質負荷、增加蛋白折疊能力或者清理受損的內質網成分，從而緩解細胞的內質網應激狀態(tài)。

2 內質網應激與炎癥反應

越來越多的證據表明，UPR信號通路和炎癥信號通路通過各種機制相互聯(lián)系，包括活性氧(ROS)的產生、內質網鈣離子的釋放、轉錄因子核因子-κB(NF-κB)、有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)的激活等，因此內質網應激誘導和/或協(xié)同促進了炎癥反應的發(fā)生和程度。

2.1 內質網應激促進活性氧的聚集引發(fā)炎癥反應活性氧是炎癥反應的重要調節(jié)子，最近的研究發(fā)現(xiàn)，內質網應激與細胞內活性氧的產生和聚集密切相關。在內質網中，蛋白質折疊形成正確構象是一個耗能的過程，因為氧化條件是分子內和分子間的二硫鍵形成所必需的。在二硫鍵形成的過程中，通過蛋白中轉驅動電子的運輸，而這涉及到位于內質網中的兩種酶:蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)和ER氧化還原酶1(ERO1)[12]。PDI直接接收電子，引起半胱氨酸殘基氧化和二硫鍵的形成。ERO1依靠四羥酮醇依賴性反應將電子從PDI轉移到分子氧上，從而使PDI氧化。雖然它提供了二硫鍵形成的強大動力，但作為終端電子接受體的分子氧的利用導致了ROS的產生[13]。因此，內質網中蛋白質折疊的負荷增加，導致ROS的積累，從而引發(fā)炎癥反應。

2.2 內質網應激導致NF-κB的活化 NF-κB是一個關鍵的轉錄調節(jié)子，在炎癥的發(fā)生方面起到核心作用。在缺乏炎癥刺激的情況下，NF-κB通過結合NF-κB的抑制子(IκB)而保持失活狀態(tài)，IκB是一種結構性表達的蛋白。NF-κB的活化過程是由信號誘導IκB的磷酸化來啟動的，磷酸化的IκB隨后被降解。IκB降解后暴露出NF-κB的核定位信號，使NF-κB轉移到細胞核，在那里引起了許多炎癥反應基因的轉錄。研究已經證明，內質網中蛋白質折疊負荷增加(例如在病毒感染期間)導致了NF-κB激活[14]。研究表明，利用鈣離子螯合劑和抗氧化劑誘導內質網應激狀態(tài)，有助于NF-κB的激活，內質網應激導致的NF-κB激活可能是由于超負荷的蛋白質折疊而引起的氧化應激和/或內質網應激相關的鈣離子泄露到細胞質中所引起的[15]。此外，對于內質網應激反應，UPR可直接通過PERK-eIF2α通路介導的翻譯減弱而促進NF-κB的激活:由于IκB的半衰期比NF-κB要短，逐漸衰減的翻譯增加了 NF-κB/IκB 的比例，從而釋放 NF-κB，在內質網應激的條件下，轉移到細胞核中。這種效應已經在誘導內質網應激藥物處理的細胞中，以及紫外線照射的細胞中被觀察到，它們都啟動了UPR的PERK激活[16]。

在哺乳動物中，IRE1α在整合內質網應激信號途徑與炎癥反應信號途徑方面起到重要作用。在內質網應激的條件下，IRE1α自體磷酸化誘導了其胞漿域構象的變化，然后結合腫瘤壞死因子-α(TNF-α)受體相關因子2(TRAF2)。IRE1α-TRAF2復合體可以募集IκB 激酶(IKK)，其可使 IκB 磷酸化，導致 IκB 的降解和NF-κB向細胞核內的轉移。與這些觀察結果相一致，對于缺乏IRE1α的小鼠胚胎成纖維細胞，內質網應激誘導的NF-κB激活和TNF-α的產生被明顯消弱。IRE1α-TRAF2復合體也可以募集蛋白激酶JNK，導致JNK的活化。被激活的JNK通過磷酸化轉錄因子激活蛋白1(AP1)而誘導炎癥因子基因的表達[17]。

3 內質網應激和病毒性肝炎

3.1 內質網應激與丙型病毒性肝炎 丙型肝炎病毒感染的細胞會產生高水平病毒蛋白，這一方面引起了針對病毒蛋白的UPR，限制病毒的翻譯;另一方面，為了抵抗內質網應激誘導的細胞調亡而發(fā)揮的自我保護作用使得病毒蛋白持續(xù)存在而呈現(xiàn)出不利作用。來自細胞培養(yǎng)和轉基因鼠模型的證據表明，丙型肝炎病毒復制子的一些成分既誘導UPR基因的表達，也引發(fā)肝損傷。例如，在Huh-7細胞中，HCV復制子誘導了sXBP-1的表達而抑制ERAD;在表達亞基因組復制子的細胞中，HCV基因表達與ATF6從細胞質轉移到細胞核中有密切關系[18]。通過上調 XBP-1的轉錄，ATF6激活UPR的IRE1-XBP-1信號途徑，而在HCV復制子表達的細胞中，雖然XBP-1的剪切mRNA和sXBP-1蛋白升高，但 sXBP-1的反式激活活性在某種程度上在丙型肝炎病毒感染細胞中被壓制，防止了內質網降解增強甘露糖苷酶樣蛋白(EDEM)轉錄誘導并且抑制了 ERAD[19]。Joyce 等[20]動物實驗研究表明，HCV 通過誘導應激及促凋亡的BAX阻止抗凋亡的NF-κB及BCL-xL的產生，使得肝細胞對凋亡更敏感，從而造成肝細胞的損害和凋亡。在細胞中表達的HCV蛋白誘導的內質網應激也可以導致鈣離子從內質網中釋放，從而激活cAMP反應元件結合蛋白(CREB)，激活的CREB能夠上調蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)，導致凋亡和肝癌的發(fā)生[21]。不僅如此，HCV核心蛋白在Huh-7或者HepG2細胞的表達可誘導C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達，促進 BAX轉移到線粒體及細胞色素 C的釋放，激活 Caspase-3和PARP的活性，促進細胞死亡[22];在HCV結構蛋白基因的轉基因小鼠中，Cleaved Caspase-3和CHOP的表達增高，促進肝細胞凋亡[23]。

HCV感染細胞中引發(fā)的UPR并不能去除HCV過量的病毒蛋白;HCV復制子也同時壓制UPR所產生的保護性作用，這樣會導致病毒的持續(xù)產生，逃避免疫清除。例如，NS3和NS5B與內質網膜相關的核糖核蛋白(RNP)形成復合體來指導并促進病毒的復制。NS4B誘導ATF6和IRE1有利于HCV亞復制子并促進HCV病毒復制[24-25]。最新細胞研究表明，被激活的內質網應激促進了HCV的復制，其機理是因為HCV激活內質網應激，而內質網應激再激活細胞自噬體的形成，而HCV利用自噬體進行大量的病毒復制[26-27]。

然而，以上研究僅僅局限于HCV的細胞模型和轉基因動物模型，這對HCV復制有很大的限制，因為這些模型中的HCV復制并不能釋放出HCV顆粒，這與臨床患者HCV復制特征存在較大的差異;除此以外，在丙型肝炎疾病進展過程中，內質網應激發(fā)揮著怎樣的作用，目前還是一片空白。目前為止，僅有一篇文獻簡單介紹了內質網應激在丙型肝炎疾病進展中的作用[28]。該研究表明，未經治療的慢性丙肝患者肝臟組織中內質網應激敏感元件ATF-6、IRE1和PERK均被激活，而三個敏感元件并不激活UPR所誘導的保護性基因，因此這與以細胞和動物模型為對象的研究結果有很大的區(qū)別。因此，以丙型肝炎患者為研究對象的內質網應激研究更具有現(xiàn)實意義。

3.2 內質網應激和乙型病毒肝炎 目前為止，關于乙型肝炎致病過程中內質網應激的國外研究不多，僅僅局限于HBV的細胞模型研究，國內研究報道也寥寥無幾。體外細胞研究結果表明，當感染HBV后，HBV表面抗原的大、中、小3種形式的包膜蛋白中，大表面蛋白過表達，使大、中、小蛋白的比例不能達到恰當水平，三者無法結合成可分泌的病毒顆粒，結果是一方面導致亞病毒和病毒顆粒的分泌受阻而積聚，造成肝細胞的毛玻璃樣變性和以及對細胞炎性因子的高敏感性，從而造成肝臟實質損傷，另一方面變異蛋白的表達還會妨礙內質網內正?？烧郫B蛋白的活性，進一步促進UPR[29-30]。HBV 的 HBX(hepatitis B virus X)蛋白是一種多功能的調節(jié)器，可誘導內質網應激的發(fā)生。HBX蛋白一方面誘導未折疊蛋白反應的ATF-6和IRE1-XBP1信號途徑誘導內質網應激;另一方面通過內質網應激誘導ATF-4促進環(huán)氧合酶2的表達，從而促進炎癥反應的發(fā)生[31]。在細胞中表達的HBV蛋白誘導的內質網應激也可以導致鈣離子從內質網中釋放，從而激活cAMP反應元件結合蛋白(CREB)，激活的CREB能夠上調蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)，進一步削弱細胞循環(huán)的調節(jié)導致凋亡和肝癌的發(fā)生[21]。此外，HBX降低參與線粒體脂肪酸β-氧化及線粒體內膜電位酶的表達，因HBX引起的ATP水平的降低通過eIF2α/ATF4通路誘導未折疊蛋白反應以及COX2表達[32]。其他研究也證明 HBX誘導 UPR，是 ATF6及IRE1-XBP1通路的重要激活物:HBX介導的這些通路可能促進HBV在肝細胞中的復制和表達，從而引起肝病甚至可能促進肝癌的發(fā)生[33]。

4 小結

在丙型病毒性肝炎和乙型病毒性肝炎疾病進展中，內質網應激發(fā)揮著重要的作用，而未折疊蛋白反應則可緩解內質網應激引起的損傷，起到一定的保護作用，但過度的內質網應激發(fā)生可引起炎癥反應和細胞凋亡，從而對宿主造成傷害。目前丙型病毒性肝炎研究較多，而乙型病毒性肝炎的研究較少，尤其在臨床患者研究方面關于兩者研究均甚少，并且內質網應激在兩者發(fā)病中的詳細機制仍不明了。因此內質網應激在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒致病進展中的作用及機制研究是我們今后的研究方向之一。

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