福氏志賀菌感染后大鼠腸功能紊亂模型建立

徐雪梅，王巧民，宋繼中，代子艷

1.安徽省立醫(yī)院消化內科，安徽 合肥 230001;2.阜陽市第一人民醫(yī)院消化內科

諸多研究包括流行病學、臨床試驗以及動物實驗都證明了感染對腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)的發(fā)生發(fā)展有重大影響，但其確切機制還不明確。由于在IBS患者中不易獲取腸組織，取材的深度和大小均受到局限，并且涉及到人體實驗的倫理學問題，建造模擬IBS發(fā)病的動物模型進行研究無疑十分重要。目前有關腸道感染和IBS關系的研究在動物實驗方面，國內外都有了一定的研究。但是用于實驗的病原體多數是旋毛蟲、線蟲等寄生蟲，用細菌進行研究的較少，而實際上與感染后腸易激綜合征(postinfectious irritable bowel syndrome，PI-IBS)有關的病原體多是細菌。當前用細菌制造PI-IBS動物模型的方法國內外比較成功的還很少見[1-2]。因此制造PI-IBS腸道細菌感染的動物模型很有必要性且具有可行性。本研究目的:用福氏志賀菌感染大鼠，制作感染后大鼠腸功能紊亂模型，以腸道急性感染消失，即病原學培養(yǎng)無致病菌生長，病理組織學顯示結腸組織無固有層中性粒細胞的浸潤和間質水腫;出現內臟高敏感性伴有或不伴有腸道運動功能異常，作為感染后腸功能紊亂動物模型建立成功的標準[1-5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 由武漢疾病控制中心提供wista大鼠，飼養(yǎng)條件Ⅱ級，雄性，體質量180～210 g。稱重編號后隨機分為實驗組和對照組。

1.2 細菌 福氏4型志賀菌由安徽醫(yī)科大學微生物教研室提供。

1.3 腸功能紊亂大鼠模型的建立 大鼠被隨機分為感染組和對照組，每組20只。感染組予2 mL的5×109cfu/mL福氏志賀菌灌胃，對照組予2 mL的生理鹽水灌胃。灌胃后每天觀察大鼠的排便情況，并后于灌胃后第1天、第3天、第14天、第21天進行大便培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2次及以上陰性的繼續(xù)下面的實驗，否則撤出實驗。內臟敏感性的測定于灌胃后的第21天、42天、63天進行。上述實驗結束后將大鼠全部處死，取回腸和結腸標本進行病理學檢查，觀察腸道的炎癥情況。

1.4 模型成功的判斷方法 (1)大鼠大便性狀觀察:灌胃后每天觀察大鼠的排便情況。大便性狀采用Bristol分級[6]。其中1～2級表示便秘，3～4級表示正常，5～7級表示有腹瀉。按照分級標準分別將1～7級賦值為1～7分，對大鼠大便性狀進行評分。(2)大便4型福氏志賀菌培養(yǎng)情況:于灌胃后第1、3、14、21天行大便培養(yǎng)，培養(yǎng)方法:取大鼠大便適量，性狀改變者取黏液、膿血部分，接種于SS培養(yǎng)板，37℃溫箱內培育18～24 h，挑取無色半透明可疑菌落，作生化反應，如果葡萄糖反應(+)，乳糖反應(－)，蔗糖反應(－)，種半固體顯示動力(－)，初步鑒定結果為福氏痢疾桿菌，再進行血清學鑒定，即福氏4型血清凝集，證明大便培養(yǎng)福氏4型志賀氏痢疾桿菌培養(yǎng)(+)，否則為志賀氏痢疾桿菌培養(yǎng)(－)。連續(xù)2次或2次以上陰性繼續(xù)下面的實驗。(3)內臟敏感性測定:在灌胃造模后第21天、42天、63天，采用直腸球囊擴張(colorectal distension，CRD)的方法觀察大鼠腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)。實驗前，禁食不禁水24 h，以減少糞便形成，并于實驗前輕觸肛門，使其排除殘余糞便。將Braun10F導尿管石蠟油潤滑后，插入直腸，使氣囊尾端距肛門1 cm，用4號手術線固定于鼠尾根部，將大鼠放入透明的鼠固定器內，使其四肢不能活動，但是能觀察其腹部回撤反射。大約30 min后，大鼠適應環(huán)境后開始注入常溫(26～28℃)生理鹽水，從0.1 mL開始，以每次0.1 mL的梯度遞增，使球囊內壓力逐漸升高。分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的容量閾值，進行評估。每次間隔30 min，重復進行3次擴張，取均值。采用直腸擴張時AWR[7]評分。記錄引起評分為3分和4分時兩個行為學反應的最小容量閾值。(4)組織形態(tài)學:水合氯醛麻醉大鼠，剖腹手術分離末端回腸(距回盲部5 cm)和近端結腸(回盲部下3 cm)，用鹽水沖洗。所有標本組織經10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進行HE染色，染色結果均由兩位病理醫(yī)師閱片診斷核實，觀察腸黏膜固有層有無中性粒細胞浸潤及間質有無水腫。具體評分如下:輕度:固有層少量中性粒細胞浸潤，輕度或無間質水腫;中度:固有層中等量中性粒細胞浸潤，間質中度水腫;重度:中量到大量中性粒細胞浸潤固有層，嚴重間質水腫。

1.5 統計學分析 應用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大便培養(yǎng) 實驗組大鼠于急性感染后第1天，大便4型福氏志賀菌培養(yǎng)結果陽性，第3天有16只大鼠培養(yǎng)陽性，至第14天及第21天，大便致病菌培養(yǎng)均為陰性，至實驗即將結束時的最后一次培養(yǎng)亦為陰性。正常對照組大鼠大便致病菌培養(yǎng)始終陰性。

2.2 大便性狀的觀察 對照組大鼠在整個實驗期間大便性狀無明顯改變。感染組在灌胃后第1～2天開始出現糞質稀薄，少數伴有黏液便，第3～4天癥狀最為明顯，Bristol分級評分為5.20 ±0.42，對照組分級評分為3.6±0.52，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)，第7天癥狀減輕，所有大鼠第10天癥狀基本消失。在第21天進行第一次內臟敏感性測定后，感染組大鼠再次出現糞便形狀不規(guī)則伴有黏液，此后有18只大鼠一直間斷有黏液便直到實驗結束，另外2只大鼠很快大便又恢復正常。

2.3 腸道感染對大鼠內臟感覺功能的影響 在感染后的第21天、42天、63天，大鼠腹部抬起(AWR評分3分)，弓背(AWR評分為4分)的容量閾值較對照組均明顯降低(P＜0.05)(見表1和表2)。然而將感染組大鼠在上述3天內腹部抬起和弓背的最小容量閾值進行比較，差異無顯著性(P＞0.05)。

表1 AWR評分為3分時的容量閾值比較(，mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(，mL)

表1 AWR評分為3分時的容量閾值比較(，mL)Tab1 Comparison of the threshold at 3 points of the AWR(，mL)

分組 第21天 第42天 第63天感染組2.26 ±0.17 2.28 ±0.18 2.23 ±0.211.04 ±0.24 1.07 ±0.19 1.12 ±0.15對照組

表2 AWR評分為4分時的容量閾值比較(，mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(，mL)

表2 AWR評分為4分時的容量閾值比較(，mL)Tab2 Comparison of the threshold at 4 points of the AWR(，mL)

分組 第21天 第42天 第63天

2.3 組織學檢查 HE染色兩組大鼠末端回腸和近端結腸未見明顯組織損傷，切片顯示未見明顯中性粒細胞浸潤，間質無明顯水腫，屬于輕度。

3 討論

當前模擬PI-IBS發(fā)病的動物模型多是以炎性介質或是寄生蟲感染作為誘發(fā)因素，而臨床上PI-IBS的發(fā)病多是在細菌感染后，而且在我國急性胃腸炎的病原體以痢疾桿菌中的福氏志賀菌最為多見，目前國內僅有個別報道福氏志賀菌感染比較成功的大鼠模型[1]，因此進一步研究4型福氏志賀菌作為致病菌來誘導PI-IBS動物模型，并研究其發(fā)病機制很有必要。

采用4型福氏志賀菌造模，在造模中采用的是2 mL 5×109cfu/mL給大鼠進行灌胃，與國內研究[2]中細菌菌量不同，我們考慮與細菌在不同培養(yǎng)環(huán)境下的毒力不同有關，比如在普通培養(yǎng)基中細菌的毒力會低于肉湯培養(yǎng)基中的毒力，而我們采用的細菌是在普通培養(yǎng)基中生長的。在實驗中我們采用給對照組大鼠灌入同等量的生理鹽水作為對照，感染組大鼠在灌胃后第1～2天后出現大便性狀改變，并且大便培養(yǎng)致病菌陽性，而對照組大便正常，大便培養(yǎng)陰性，說明感染成功。

由于IBS的診斷是基于癥狀的診斷，缺乏生物學標準，因此造成動物模型評判標準無法統一，現有的動物模型還不能將IBS同其他的功能性疾病進行區(qū)分。因此，目前還沒有理想的研究IBS的動物模型。早先的研究認為對腸腔擴張刺激的敏感性增加是IBS患者的共同特征之一[8-9]。內臟高敏感性被認為是IBS的基本特征[10]。因此，當前關于IBS的動物模型多以內臟敏感性增加作為IBS動物模型成功的標志。我們在實驗中測定大鼠內臟敏感性的方法是采用了應用最為廣泛的即通過對大鼠進行CRD，觀察大鼠AWR的方法，每次刺激間隔30 min，重復3次進行。我們選用了AWR評分中改變最客觀也最易觀察的兩個大鼠行為學反應，即腹部抬離桌面和弓背，由非實驗人員進行AWR評分，最大限度地減少主觀原因造成的偏差。之所以選擇感染后第21天開始進行內臟敏感性的測定，是因為文獻記載感染后急性炎癥消失一般在第3～4周左右[1-5]。此后我們每隔3周重復進行內臟敏感性的測定，是為了觀察其內臟敏感性是否持續(xù)增高。

本實驗中用福氏志賀菌感染大鼠后，在急性期大鼠出現大便性狀的改變，并且經大便培養(yǎng)確定感染成功，此后連續(xù)2次培養(yǎng)陰性后，大鼠仍有反復持續(xù)的大便性狀改變，伴有內臟敏感性持續(xù)而顯著的增高，病理切片顯示在末端回腸及近端結腸均無明顯中性粒細胞浸潤及間質水腫，說明感染后大鼠腸功能紊亂模型成功。并且大鼠大便性狀改變和內臟敏感性增加持續(xù)到感染后9周，說明感染后大鼠具有感覺和動力的雙重障礙，更加符合腸功能紊亂慢性復發(fā)性的特點，更貼近于IBS的臨床特點。

[1]Guo M，Li YQ，Yu XJ，et al.Establishment of the post-infectious bowel dysfunction model[J].Journal of Shandong University(Health Science)，2006，44(6):586-589.郭敏，李延青，于秀娟，等.大鼠急性腸道感染后腸功能紊亂動物模型的建立[J].山東大學學報(醫(yī)學版)2006，44(6):586-589.

[2]Pimentel M，Chatterjee S，Chang C，et al.A new rat model links two contemporary theories in irritable bowel syndrome [J].Dig Dis Sci，2008，53(4):982-989.

[3]Barbara G，Vallance BA，Collins SM.Persistent intestinal neuromuscular dysfunction after acute nematode infection in mice[J].Gastroenterology，1997，113(4):1224-1232.

[4]Bercík P，Wang L，Verdú EF，et al.Visceral hyperalgesia and intestinal dysmotility in a mouse model of postinfective gut dysfunction [J].Gastroenterology，2004，127(1):179-187.

[5]Barbara G，De Giorgio R，Deng Y，et al.Role of immunologic factors and cyclooxygenase 2 in persistent postinfective enteric muscle dysfunction in mice[J].Gastroenterology，2001，120(7):1729-1736.

[6]O’Donnell LJ，Virjee J，Heaton KW.Detection of pseudodiarrhoea by simple clinical assessment of intestinal transit rate[J].BMJ，1990，300(6722):439-440.

[7]Al-Chaer ED，Kawasaki M，Pasricha PJ.A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development [J]. Gastroenterology，2000，119(5):1276-1285.

[8]Saunders PR，Santos J，Hanssen NP，et al.Physical and psychological stress in rats enhances colonic epithelial permeability via peripheral CRH[J].Dig Dis Sci，2002，47(1):208-215.

[9]Brandt EB，Strait RT，Hershko D，et al.Mast cells are required for experimental oral allergen-induced diarrhea [J].J Clin Invest，2003，112(11):1666-1677.

[10]Nazli A，Yang PC，Jury J，et al.Epithelia under metabolic stress perceive commensal bacteria as a threat[J].Am J Pathol，2004，164(3):947-957.