HGF及G-CSF誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肝樣細胞

高 勇，梅浙川*，蔣明德

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內科，重慶400016;2.成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內科，四川成都610083)

近年來，關于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的研究已經(jīng)成為干細胞研究的熱點，BM-MSCs 在不同條件的誘導下可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肝細胞、神經(jīng)元等［1－2］。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是現(xiàn)在已知的肝細胞最強的促有絲分裂劑，被大量用于肝相關干細胞體外誘導分化的實驗，可調控BM-MSCs 分化為肝細胞［3］。粒細胞集落刺激因子(granlocyte-colony stimulating factor，G-CSF)是一個大小為20 ku的糖蛋白，G-CSF 被廣泛的用作于化療時的輔助藥物以及干細胞移植前的動員，關于G-CSF 體外誘導的報道很少。研究顯示，用0.1 μmol/L G-CSF 培養(yǎng)的BM-MSCs 表達的HGF水平最高［4］;血清中添加了G-CSF 后可以促進BM-MSCs的增值，并且能提高BM-MSCs 的活性［5］。本實驗的目的是探討HGF 以及G-CSF 可否誘導大鼠BM-MSCs 分化為肝樣細胞，為干細胞的研究提供更有效的誘導方案。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠，3 ～4 周，體質量80 ～100 g，［四川華西醫(yī)科大學實驗室(SCXK(111)2009-09)］。

1.2 主要試劑

胎牛血清和低糖培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，Trizol RNA(寶生物公司)，反轉錄試劑盒(Fermentas 公司)，引物由上海生工合成，肝細胞生長因子(Peprotech 公司)，重組人粒細胞集落刺激因子注射液(山東齊魯制藥公司)，小鼠抗大鼠甲胎蛋白單克隆抗體和小鼠抗大鼠白蛋白單克隆抗體(Orbigen 公司)，羊抗小鼠(博士德公司)。GAPDH 內參(上?？党枪?。兔抗鼠CD45-FITC、CD34-PE、CD90-FITC 和CD105-PE 單抗(Santa 公司)。

1.3 大鼠BM-MSCs 的鑒定以及體外分組及誘導

取P3 代的大鼠BM-MSCs，胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液，取2 ×105個細胞，分別加入兔抗鼠CD45-FITC、CD34-PE、CD90-FITC 和CD105-PE 單抗，室溫避光孵育20 min，上流式細胞儀進行檢測。

取P3 代BM-MSCs 細胞，接種在6 孔板中，約1.2 ×104個/孔，待1 ～2 d后細胞生長狀況良好，長滿1/3 ～1/2個孔后，分別加入已配置好的培養(yǎng)液。實驗分為:對照組:10% 胎牛血清培養(yǎng)基，0.1 μmol/L G-CSF 干預組，20 ng/mL HGF 干預組，HGF 聯(lián)合G-CSF 共同干預組(0.1 μmol/L G-CSF +20 ng/mL HGF)，分別將誘導后第7、14 和21 天提取細胞總RNA 以及總蛋白。

1.4 RT-PCR 檢測白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA 轉錄

分別用RNAiso Plus 提取誘導第7、14 和21 天細胞的總RNA，再用Fermentas 公司反轉錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH 為內參，GAPDH 引物序列F5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG，R5'-GTCCAC CACCCTGTTGCTGTAG，產(chǎn)物大小496 bp。引物為AFP:F5'-ACTCCGGTATCAACC ACTGC，R5'-GGTC TTTGCAGCACTTCTCC，擴增產(chǎn)物長500 bp。ALB:F5'-TCTATGCCCCAGAACTCCTTTA，R5'-CACTCCTT GTTGATTTTGGTGA，擴增產(chǎn)物長289 bp，所有的引物均由上海生工合成。按照以下條件進行擴增:94 ℃2 min;94 ℃30 s、55 ℃45 s、72 ℃1 min擴增30 個循環(huán)，72 ℃1 min。將擴增PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像。

1.5 Western blot 檢測白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)表達水平

將誘導第7、14 和21 天的細胞提取總蛋白，10%分離膠液以及5%濃縮膠液SDS-PAGE 電泳，每組加入50 μg總蛋白，電泳后轉移到PVDF 膜上，封閉，加入小鼠抗大鼠甲胎蛋白單克隆抗體(1∶500稀釋)和小鼠抗大鼠白蛋白單克隆抗體(1∶800 稀釋)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入HRP 標記的山羊抗小鼠抗體(1∶10 000稀釋)，再孵育1 h，暗室和UVP曝光。用ALB/GAPDH、AFP/GAPDH 的吸光度比值作為ALB、AFP 的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠BM-MSCs 分離培養(yǎng)及誘導結果

鏡下所見，P0 代BM-MSCs 24 h貼壁，3 ～5 d后細胞呈梭狀，形成小細胞集落，逐漸增大，呈漩渦狀;20 ng/mL HGF 干預組，HGF 聯(lián)合G-CSF 共同干預組誘導第7 天，部分梭狀細胞變成圓形細胞，誘導14 d大多數(shù)細胞變圓，并形成集落，形似肝細胞(圖1)。

2.2 大鼠BM-MSCs 流式細胞表面標記結果

P3 代BM-MSCs 細胞表面標志物CD34、CD45、CD90 和CD105 表達量分別為:CD34-PE 0.3%、CD45-FITC 0.1%、CD90-FITC 99.6% 和CD105-PE 99.8%(圖2)。

2.3 RT-PCR 檢測肝細胞ALB、AFP mRNA 轉錄水平

對照組、0.1 μmol/L G-CSF 干預組均沒有檢測到ALB 和AFP mRNA 水平表達。20 ng/mL HGF 干預組和HGF 聯(lián)合G-CSF 共同干預組在誘導后第7，14 和21 天均檢測到ALB mRNA 水平表達，隨時間遞增，同一時間后者表達量高于前者(分別為P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05);在誘導后第7、14 天檢測到AFP mRNA 水平表達，隨時間遞減，第21 天沒有檢測到AFP mRNA 水平表達，兩組在同一時間比較(P＜0.01)(圖3，4)(表1)。

2.4 Western blot 檢測肝樣細胞ALB 和AFP 蛋白水平

對照組、0.1 μmol/L G-CSF 干預組均未檢測到ALB 和AFP 蛋白水平表達。20 ng/mL HGF 干預組和HGF 聯(lián)合G-CSF 共同干預組在誘導后第7、14 和21 天均檢測到ALB 蛋白水平表達，隨時間遞增，后者表達量高于前者，同一時間差異相比(分別為P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01);在誘導后第7、14 天檢測到AFP 蛋白水平表達，隨時間遞減，第21 天沒有檢測到AFP 蛋白水平表達，兩組在同一時間差異相比(P＜0.05)(圖5，6)(表2)。

3 討論

骨髓中BM-MSCs 含量很低，占所含細胞的0.01% ～0.001%，并隨著動物年齡的增長會逐漸降低。本實驗選取3 ～4 周的幼年SD 大鼠，用貼壁培養(yǎng)法獲的原代BM-MSCs。迄今為止，對BM-MSCs表面標志物還不確定，本實驗流式細胞術鑒定表面標志，CD34、CD45 陰性，高表達CD90、CD105，符合骨髓間充質干細胞的流式細胞表面標志［6－8］。

圖3 誘導后各組細胞ALB 和AFP 基因水平表達Fig 3 ALB and AFP detected by RT-PCR after induction

表1 各組不同時間ALB(AFP)mRNA/GAPDH 吸光度值Table 1 Absorbance ratio of mRNA of ALB or AFP to GAPDH on different days for every group

表2 各組不同時間ALB(AFP)蛋白/GAPDH 吸光度值Table 2 Absorbance ratio of protein of ALB or AFP to GAPDH on different days for every group

圖6 第7、14、21 天ALB 和AFP 蛋白表達Fig 6 Tthe expression of ALB and AFP protien detected by Western blot on 7th、14th and 21th day

本實驗20 ng/mL HGF 干預組和HGF 聯(lián)合G-CSF共同干預組檢測到了ALB 和AFP 基因水平和蛋白水平的表達，說明HGF 能夠誘導BM-MSCs 分化為肝樣細胞，這與既往研究一致，用50 ng/mL HGF 誘導BM-MSCs，RT-PCR 以及Western blot 檢測AFP 和ALB 表達水平，表明HGF 能誘導BM-MSCs分化為肝樣細胞［9］;用HGF、aFGF 和OSM 誘導BM-MSCs，并證實HGF、aFGF 和OSM 誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為肝樣細胞的可行性［10］。另外，HGF 聯(lián)合G-CSF 共同干預組同20 ng/mL HGF 干預組相比，均檢測到了ALB 和AFP 基因和蛋白水平的表達，并且趨勢是一致的，每個指標并在同一時間比較有統(tǒng)計學意義，這與既往研究類似。研究發(fā)現(xiàn)添加0.1 μmol/L G-CSF 培養(yǎng)BM-MSCs 能夠顯著提高BM-MSCs 增殖能力，并且促進很多生長因子的產(chǎn)生［11］。由此得出，G-CSF 對HGF 的誘導起了協(xié)同作用，可能的機制是促進細胞的增殖，以及促進細胞產(chǎn)生HGF 有關系，還需要進一步的實驗研究。

綜上所述，本實驗建立了一種有效的BM-MSCs分化為肝樣細胞誘導方案，為干細胞的研究提供參考，但是肝內病理微環(huán)境復雜，究竟什么濃度的G-CSF以及HGF 誘導效果更好，是否有其他更強的誘導劑可以用于體外實驗等問題，尚待進一步的實驗研究。

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