與人遺傳病相關(guān)的DNA重復序列的體外核小體定位特性

柴 榮，趙宏宇，蔡 祿

(內(nèi)蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，內(nèi)蒙古包頭014010)

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40 余種人類神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病與DNA 重復序列擴增或刪除有關(guān)［1］，比如，(CTG)n·(CAG)n 的擴增或刪除可能會引起脊髓小腦共濟失調(diào)1、2、3、6、7、8、12 和17 型以及肌強直性營養(yǎng)不良1 型等，位于FRDA 基因1 號內(nèi)含子上的GAA重復序列異常擴增會引起Friedreich 共濟失調(diào)［2］，ATXN10 基因含有較長的ATTCT 重復片段會導致脊髓小腦共濟失調(diào)10 型［3］，而肌強直性營養(yǎng)不良2 型則可能與(GCCT)n·(CAGG)n 擴增有關(guān)［4］。近十余年該領(lǐng)域的研究主要集中在重復序列形成的異常2 級結(jié)構(gòu)以及遺傳不穩(wěn)定性［5］，對于重復序列的核小體定位以及對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響了解甚少。僅有少量工作表明，將重復序列純化后，體外與組蛋白組裝形成核小體的能力有所差異，發(fā)現(xiàn)CTG 重復片段容易形成核小體［6］，ATTCT 重復序列對組蛋白的親和性較強［7］，而GAA 重復序列則很難形成核小體［8］。Widom 601 序列是較為穩(wěn)定、容易形成核小體的序列［9］。本實驗構(gòu)建了含有601 序列的重組質(zhì)粒pUC601 作為對照，并體外用鹽透析法組裝染色質(zhì)及摸索微球菌核酸酶酶切條件。然后用本實驗室構(gòu)建的含有上述人遺傳病相關(guān)重復序列的質(zhì)粒體外組裝染色質(zhì)與微球菌核酸酶酶切分析方法，在質(zhì)粒層次初步研究了重復序列核小體定位的特性，為該類疾病機理的理解奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株:大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pUC19、pBS-601 由本實驗室保存。重組質(zhì)粒pUC(GAA)42、pUC(ATTCT)43和pUC(GCCT)18由本實驗室構(gòu)建，在質(zhì)粒的多克隆位點分別含有重復序列(GAA)42、(ATTCT)43和(GCCT)18［10］。

1.1.2 試劑:質(zhì)粒小提試劑盒(上海生工)，微球菌核酸酶(MNase)、LD1000 標志、寬譜DNA 標志、蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 含601 序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建:用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ雙酶切pBS-601，分離199 bp的601 序列，連接到pUC19 質(zhì)粒的BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之間，轉(zhuǎn)入E．coli DH5α 中，涂布在含氨芐青霉素的固體LB 平板上進行篩選，陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ雙酶切進行鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒通過測序確認其完整性。

1.2.2 質(zhì)粒提取:用質(zhì)粒小提試劑盒小量提取質(zhì)粒。按照參考文獻中的方法大量提取質(zhì)粒［11］。

1.2.3 組蛋白八聚體表達、純化與復性:挑取含有H2A，H2B，H3，H4 基因的重組質(zhì)粒的單菌落于25 mL 氨芐加氯霉素 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min，過夜培養(yǎng);取10 mL菌液加入到750 mL氨芐加氯霉素LB 培養(yǎng)基中;當OD600 達到0.4 ～0.6時，培養(yǎng)液中加入375 μL IPTG(1 mol/L)。37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)3 ～4 h;收集培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 ×g離心50 min，去上清，再用80 mL PBS 緩沖液充分重懸菌體沉淀，4 ℃、4 000 ×g離心30 min，去上清;將先前收的H2A、H2B、H3 和H4 菌液用100 mL洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris，100 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Benzamidine)重懸，再超聲充分破碎細菌，4 ℃、23 000 ×g 離心20 min，去上清;用洗脫緩沖液+1% Triton-X 100 充分重懸沉淀，4 ℃、20 000 ×g離心10 min，去上清，重復此步;用洗脫緩沖液充分重懸沉淀，4 ℃、20 000 ×g離心10 min，去上清;用30 mL解折疊緩沖液(7 mol/L 鹽酸胍，20 mmol/L Tris，10 mmol/L DTT)充分溶解沉淀，室溫攪拌1 h 溶解;20 ℃、23 000 ×g離心20 min，保留上清，測定濃度;取5 mg的H2A，H2B，H3，H4 加入透析袋中，置于重折疊緩沖液(2 mol/L 氯化鈉，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)中透析，4 ℃攪拌12 h后，再換一次透析液，4 ℃透析24 h。將透析液取出，4 ℃、13 000 r/min，離心5 min，收集上清，再將樣品濃縮至500 μL。過分子篩柱，收集片段;電泳檢測。

1.2.4 體外組裝核小體:將純化的組蛋白八聚體與重組質(zhì)粒以一定的比例加入到含有2 mol/L氯化鈉的TE 緩沖液中混勻，總體系80 μL，然后加入透析管(Thermo，10 000 MWCO)中，放入含2 mol/L氯化鈉的TE 透析液中透析16 h，在此過程中用恒流泵(HL-ZS，上海青浦西儀器廠)將TE 緩沖液勻速滴入透析液中，使其中氯化鈉的濃度降到0.6 mol/L;之后將透析管轉(zhuǎn)入到不含有氯化鈉的TE 緩沖液中透析3 ～6 h。

1.2.5 MNase 酶切:取組裝后含有4 μg DNA 的樣品、微球菌核酸酶120 ～360 mU、10 × MNase 緩沖液，用滅菌水補齊到80 μL，37 ℃水浴，酶切5 ～15 min;等體積終止緩沖液(20 mmol/L EDTA，0.2 mol/L氯化鈉，1% SDS，0.25 g/L甘油)終止反應，加入2 μL 100 g/L蛋白酶K，55 ℃反應30 min;等體積酚氯仿抽提，將上清轉(zhuǎn)移到新管，加入2 倍體積無水乙醇，1/10 體積3 mol/L 的乙酸(pH 5.2)，1 μL 20 g/L 糖原，－20 ℃ 沉淀過夜;4 ℃，12 000 r/min離心15 min，去上清;70%乙醇洗1 次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，室溫晾干，20 μL TE緩沖液溶解。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳:微球菌核酸酶酶切處理后DNA 樣品在1.3%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后EB染色，凝膠成像儀拍照觀察分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pUC-601 與重組質(zhì)粒pUC(GAA)42、pUC(ATTCT)43、pUC(GCCT)18除了多克隆位點之間的目的片段不同外其余均相同(圖1A)。將構(gòu)建的pUC601 挑取兩個亞克隆用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ雙酶切后可以得到2674bp和199 bp兩條片段(圖1B)。測序后其序列完全正確。

2.2 組蛋白的純化與復性

純化的單個組蛋白H2A(14 ku)、H2B(14 ku)、H3(15 ku)和H4(13 ku)(圖2A)，條帶位置正確，純度較高。復性后形成的組蛋白八聚體經(jīng)AKTA 系統(tǒng)分子篩純化后，可見樣品C2 至C4 為純度較高組蛋白八聚體(圖2B)，將回收的C2 至C4 樣品混合測定濃度后，分裝凍存于－80 ℃用于后續(xù)組裝實驗。

2.3 組蛋白與DNA 組裝最適比例的確定

將組蛋白八聚體與重組質(zhì)粒pUC601 分別以質(zhì)量比為0.7、1.1 和1.5 3 個不同的比例體外組裝形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，透析后用360 mU的微球菌核酸酶進行酶切(圖3)。從圖中可以看出，組蛋白與DNA 的比例為1∶1時酶切可以形成明顯的梯度條帶，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為均勻。所以后面的實驗選擇組蛋白與DNA 的質(zhì)量比為1∶1進行組裝。

2.4 最適酶量的確定

為了選擇反應體系中微球菌核酸酶的酶量，將組蛋白與重組質(zhì)粒pUC601 以1∶1比例進行體外組裝染色質(zhì)，透析后分別用120、240、360和480 mU的微球菌核酸酶進行酶切10 min(圖4)。從圖中可以看出用360 mU酶量切得到單個核小體的DNA 條帶較明亮，且條帶的梯度整齊，所以后續(xù)實驗用360 mU的酶量來進行酶切。

圖3 不同比例下pUC601 體外組裝染色質(zhì)微球菌核酸酶酶切結(jié)果Fig 3 Micrococcal nuclease digestion assay of pUC601 assembly chromatin in vitro in different ratio

圖4 不同微球菌核酸酶酶量消化體外組裝染色質(zhì)的結(jié)果Fig 4 Micrococcal nuclease digestion assay of assembly chromatin in vitro in different enzyme amount

2.5 最適酶切時間的確定

微球菌核酸酶酶切反應對時間較為敏感，為了選擇最佳酶切時間，將組蛋白與重組質(zhì)粒pUC601以1∶1的比例體外組裝形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，透析后加微球菌核酸酶360 mU，分別酶切5、10 和15 min(圖5)。從圖中可以看出10 和15 min時的酶切效果基本一致，條帶明亮整齊，梯度明顯，因此選擇10 min進行酶切。

圖5 不同酶切時間消化體外組裝染色質(zhì)的結(jié)果Fig 5 Micrococcal nuclease digestion assay of assembly chromatin in vitro in different digestion time

2.6 不同質(zhì)粒形成核小體能力的比較

在以上組裝及酶切條件下，分別將組蛋白與重組質(zhì)粒pUC601、pUC(GAA)42、pUC(ATTCT)43和pUC(GCCT)18以1∶1比例體外組裝形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，用微球菌核酸酶360 mU、37 ℃酶切10 min(圖6)。從圖中可以看出在同樣的條件下，質(zhì)粒pUC(ATTCT)43酶切后形成的梯度條帶位置靠上，可見明顯的4 條帶;質(zhì)粒pUC(GAA)42的酶切后主要形成3條梯度的條帶，且位置相對靠下;而pUC(GCCT)18介于pUC(ATTCT)43和pUC(GAA)42之間。

3 討論

目前，染色質(zhì)體外組裝主要有兩種方式:一種是采用鹽透析的方法，另一種是依賴ATP 及蛋白因子(dNAP I 和ACF)進行的染色體體外組裝［12］。而鹽透析方法裝配染色質(zhì)系統(tǒng)內(nèi)只含有組蛋白和DNA，不需要加入特殊的蛋白質(zhì)，因此產(chǎn)生的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)僅依賴于DNA 序列的核小體定位特性。實驗以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC601 為模板，用鹽透析方法體外與組蛋白形成核小體結(jié)構(gòu)，確定了微球菌核酸酶的酶切時間和酶量，然后用這個條件進一步比較了含有與人遺傳病相關(guān)的3 種重復序列的質(zhì)粒形成核小體能力的區(qū)別。

圖6 不同質(zhì)粒與組蛋白組裝后酶切比較電泳結(jié)果Fig 6 Micrococcal nuclease digestion assay of assembly chromatin in vitro in different recombinant plasmids

可以看出在同樣的條件下，質(zhì)粒pUC(ATT CT)43酶切后形成的梯度條帶位置靠上，可以看到明顯的4 條帶，相比其他質(zhì)粒不容易被切開，說明染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為緊密;質(zhì)粒pUC(GAA)42的酶切后主要形成3 條梯度的條帶，且位置相對靠下，表明易被微球菌核酸酶消化，提示染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相對比較松散;而pUC(GCCT)18體外組裝形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)后酶切的難易程度介于pUC(ATTCT)43和pUC(GAA)42之間。而已有工作表明重復序列ATTCT 比GAA 容易形成核小體［7］，這與本實驗結(jié)果一致。實驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒除了多克隆位點插入的重復序列片段不同，其余側(cè)翼序列均一致，所以其形成核小體結(jié)構(gòu)能力不同的主要原因是由于插入了不同的重復序列片段。據(jù)此結(jié)果推測，GAA 重復序列本身對組蛋白的親和力弱，而ATTCT 易形成核小體，所以含有ATTCT 重復序列片段的質(zhì)粒比含有GAA 重復序列的質(zhì)粒體外形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)要相對緊密，核小體的占據(jù)情況要稍高。但是對于重復序列是否能形成異常的二級結(jié)構(gòu)以及其可能對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，仍需要進一步的研究。本實驗對于由DNA 重復序列引起的人遺傳病致病機理在核小體及染色質(zhì)水平的理解具有一定的意義。

志謝:組蛋白八聚體的表達、純化與復性在中國科學院生物物理研究所李國紅課題組完成，感謝李國紅研究員給予的幫助與指導。

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