亞硒酸鈉通過(guò)AMPK/mTOR通路調(diào)控白血病NB4細(xì)胞凋亡

段 婧，羅 慧，史可鑒，楊 洋，許彩民

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京100005)

白血病是一類由于造血干細(xì)胞異常引起的克隆性惡性血液疾?。?］。硒是具有抗癌作用的人體必需微量元素之一，大量證據(jù)表明，超營(yíng)養(yǎng)劑量的硒能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。亞硒酸鈉是一種潛在的白血病治療藥物，但是硒化合物的抗癌機(jī)制，尤其是特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉可以通過(guò)多條通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡［2－4］。本實(shí)驗(yàn)主要探討AMPK/mTOR通路在這個(gè)過(guò)程中所起的作用。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由一個(gè)催化亞基(α)和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β和γ)3個(gè)亞單位組成。本實(shí)驗(yàn)研究AMPKα亞基的蘇氨酸172位磷酸化。AMPK能夠重編程細(xì)胞的能量代謝，同時(shí)通過(guò)mTOR、P53 調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬［5－6］。AMPK 作為感受細(xì)胞能量的開(kāi)關(guān)在細(xì)胞的代謝調(diào)控中起到十分重要的作用。現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞代謝紊亂密切相關(guān)［7］。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明AMPK在許多腫瘤細(xì)胞中都是異常激活的［8－9］，它的磷酸化激活可以對(duì)細(xì)胞能量代謝過(guò)程的一些關(guān)鍵蛋白激酶如:mTOR、PI3K及SREBP-1等進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)用AMPKα亞基的特異性激活劑AICAR和干擾序列對(duì)AMPK及其相關(guān)蛋白mTOR在亞硒酸鈉誘導(dǎo)白血病NB4細(xì)胞凋亡的過(guò)程中所起的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:NB4細(xì)胞系(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所惠贈(zèng))，表達(dá)野生型功能性P53基因。

1.1.2 試劑與抗體:亞硒酸鈉(Sigma-Aldrich公司);兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-P70S6K抗體和兔抗人p-mTOR抗體(Cell Signaling Technology公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Scientific公司);AMPKα1/2干擾序列(Santa Cruz公司sc-45312);Annexin V/PI染色試劑盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將NB4細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清1640培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)起始濃度為4×105個(gè)/mL。

1.2.2 細(xì)胞處理:分別采用0、2、5、10和20μmol/L亞硒酸鈉及20μmol/L亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞0、3、6、12和24 h，提取細(xì)胞總蛋白。激活A(yù)MPK時(shí)分別采用1 mmol/L的AMPKα亞基的特異激活劑AICAR以及1 mmol/L的AICAR預(yù)處理1 h后用20μmol/L的亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞;干擾AMPK時(shí)分別采用AMPKα1特異的siRNA和siRNA干擾過(guò)夜后再用20μmol/L的亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞。激活和干擾處理后24 h提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白以及AnnexinV/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 Western blot方法:收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗1次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，超聲5 s，每個(gè)樣品6次，離心收集上清液即為總蛋白溶液。用Bradford法測(cè)量蛋白含量，取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過(guò)夜。TBST洗膜，用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL顯色發(fā)光檢測(cè)相應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4 RNA干擾實(shí)驗(yàn):1 mL無(wú)血清無(wú)雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基將NB4細(xì)胞稀釋成106個(gè)/mL鋪到12孔板中37℃，5%CO2預(yù)培養(yǎng)。在一個(gè)無(wú)RNA酶的離心管中用Opti-MEM將siRNA母液配成100μL 50 nmol/L的工作液，在另一個(gè)無(wú)RNA酶的離心管中用97μL Opti-MEM稀釋3μL的DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑。兩管分別混勻靜置5 min后，將兩管混勻室溫孵育20 min。將配制好的混合液加入含有1 mL Opti-MEM的培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染6 h后，往培養(yǎng)板中加入新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后用亞硒酸鈉處理，再培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率:約106個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)激活或干擾后，收集細(xì)胞，1 000×g離心5 min，冰冷PBS洗滌1次。收集約105個(gè)細(xì)胞用100μL含2μL Annexin V-FITC染料和0.1μL PI染料的Binding緩沖液將細(xì)胞懸浮，避光15 min，過(guò)篩后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 免疫共沉淀:約107個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)硒處理24 h后，收集細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min(r=8.5 cm)離心15 min收集蛋白上清;Bradford法對(duì)蛋白定量后，調(diào)蛋白濃度成一致;用相應(yīng)一抗免疫沉淀目標(biāo)蛋白，4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜;然后用25μL瓊脂糖珠子捕獲免疫沉淀復(fù)合物，4℃反應(yīng)3 h;RIPA洗滌沉淀復(fù)合物3遍，3×SDS loading緩沖液重懸沉淀，煮沸后使蛋白變性;離心收集樣品上清，－80℃保存或進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉對(duì)NB4細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影響

亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞后隨著亞硒酸鈉濃度增加、處理時(shí)間延長(zhǎng)，AMPK蛋白的磷酸化水平上升(圖1)。

2.2 亞硒酸鈉對(duì)NB4細(xì)胞中mTOR及P70S6K蛋白磷酸化水平的影響

亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞后隨著亞硒酸鈉濃度增加、處理時(shí)間延長(zhǎng)，mTOR及P70S6K蛋白的磷酸化水平下調(diào)(圖2)。

2.3 激活A(yù)MPK對(duì)亞硒酸鈉處理后NB4細(xì)胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平以及細(xì)胞凋亡的影響

和對(duì)照組相比，亞硒酸鈉、AICAR以及亞硒酸鈉和 AICAR聯(lián)用均能夠明顯激活 AMPK，抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯(圖3A)。亞硒酸鈉、AICAR以及亞硒酸鈉和AICAR聯(lián)用處理后細(xì)胞的凋亡率相比對(duì)照組均有明顯上升(圖3B)。

2.4 干擾AMPK對(duì)亞硒酸鈉處理后NB4細(xì)胞中mTOR、P70S6K磷酸化水平及細(xì)胞凋亡的影響

相比亞硒酸鈉處理組，AMPKα1 siRNA以及亞硒酸鈉和AMPKα1聯(lián)用處理組，mTOR、P70S6K磷酸化水平有顯著上升、凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯減弱(圖4A)，AMPKα1 siRNA及亞硒酸鈉和AMPKα1 siRNA聯(lián)用處理后細(xì)胞的凋亡率相比亞硒酸鈉處理組均有明顯下降(圖4B)。

圖5 亞硒酸鈉對(duì)NB4細(xì)胞中AMPK和mTOR相互作用的影響Fig 5 Effect of sodium selenite on interaction between AMPK and mTOR in NB4 leukemia cancer cells

2.5 AMPK和mTOR有相互作用

亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞24 h后AMPK和mTOR之間的確存在直接的相互作用(圖5)。

3 討論

硒是一種具有潛在抗癌作用的微量元素。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果證明，在某些含硒量高的地區(qū)，癌癥發(fā)病率較低。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明，在NB4細(xì)胞中亞硒酸鈉通過(guò)抑制mTOR可以抑制自噬，進(jìn)而促進(jìn)凋亡［10］，動(dòng)物模型也證明硒可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)［11］。

AMPK是能量代謝和自噬、凋亡調(diào)控中的重要分子［12］。在細(xì)胞內(nèi) AMPK被激活后可對(duì) P53、mTOR等凋亡自噬中的關(guān)鍵調(diào)控分子進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的凋亡自噬進(jìn)行調(diào)控［13－14］。推測(cè)AMPK作為mTOR的上游分子，通過(guò)抑制自噬促進(jìn)了凋亡。

本研究采用不同濃度亞硒酸鈉及不同時(shí)間處理NB4細(xì)胞后檢測(cè)AMPK、mTOR以及P70S6K的磷酸化水平及其在調(diào)控凋亡過(guò)程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉濃度的增大，處理時(shí)間的增長(zhǎng)，AMPK的磷酸化水平顯著增加，而mTOR以及P70S6K的磷酸化水平顯著降低。用AMPK的激活劑AICAR處理NB4細(xì)胞24 h后，能夠顯著激活 AMPK、抑制mTOR以及P70S6K，凋亡相關(guān)分子PARP切割明顯增多;流式細(xì)胞結(jié)果也顯示激活A(yù)MPK后細(xì)胞的凋亡率相比對(duì)照組均有明顯上升。AICAR與亞硒酸鈉對(duì)NB4細(xì)胞的類似影響提示亞硒酸鈉可能通過(guò)激活A(yù)MPK、抑制mTOR從而促進(jìn)NB4細(xì)胞凋亡。

干擾AMPK后NB4細(xì)胞中mTOR以及P70S6K的磷酸化水平相比對(duì)照組明顯增加，表明AMPK的確對(duì)mTOR存在抑制作用;同時(shí)流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)表明和亞硒酸鈉處理組相比，干擾AMPK后亞硒酸鈉處理組的凋亡率有顯著下降。以上結(jié)果表明，干擾AMPK可以減弱對(duì)mTOR的抑制，拮抗亞硒酸鈉對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，AMPK和mTOR之間存在直接相互作用，提示亞硒酸鈉引起的AMPK蘇氨酸172位的磷酸化激活可能對(duì)mTOR的活性起到直接的負(fù)調(diào)控作用。

綜上研究結(jié)果證明，亞硒酸鈉可激活白血病NB4細(xì)胞中AMPKα，進(jìn)而抑制mTOR以及P70S6K的磷酸化水平，從而促進(jìn)NB4細(xì)胞凋亡，AMPK與mTOR之間的相互作用可能對(duì)它們協(xié)同調(diào)控NB4細(xì)胞凋亡起到了一定的作用。

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