5個苜蓿品種葉片表面蠟質覆蓋與抗旱性的關系

周玲艷，劉勝洪，秦華明，黎佩鳳，楊鳳婷，趙 鋼

(1.仲愷農業(yè)工程學院生命科學學院，廣東 廣州 510225； 2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510623)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上最主要的栽培面積最廣的優(yōu)良豆科牧草之一，以“牧草之王”著稱，在草田輪作、植被恢復和家畜養(yǎng)殖等方面發(fā)揮著重要作用[1]。但苜蓿生育期需水較多，每形成1 g干物質需水700～800 g，田間需水量達5 855 m3·hm-2。而我國苜蓿主栽區(qū)干旱缺水，嚴重制約著苜蓿的大面積推廣，因此，對苜蓿的抗旱性研究顯得尤為重要。在過去幾十年里，對苜蓿的抗旱性研究取得了很多成果，研究內容從抗旱性的鑒定方面逐步轉移到提高苜蓿自身抗旱性的研究上來。目前，苜?？购敌杂N方面的研究已經成為該領域的主要研究方向。

植物表皮蠟質是覆蓋于植物表皮角質層上的一層可見的蠟狀隆起，在通過調控植物表皮滲透性、限制非氣孔性水分喪失以抵御水分脅迫方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。張志飛等[5]發(fā)現(xiàn)高羊茅(Festucaelata)葉片表皮蠟質可通過對氣孔導度的調節(jié)來減少氣孔蒸騰，提高水分利用效率，最終提高其抗旱性。張正斌和山侖[4]研究表明，蠟質含量與蒸騰速率呈顯著正相關。Vogg等[6]在對番茄(Lycopersiconesculentum)蠟質研究中發(fā)現(xiàn)，內表皮蠟質起著蒸騰屏障的作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7-8]、水稻(Oryzasativa)[9]以及細莖冰草(Elymustrachycaulum)[10]中也均發(fā)現(xiàn)蠟質含量與植物抗干旱能力呈正相關。也有研究者認為，角質層蠟質組成[11-15]以及蠟質結構[16]是決定植物抗旱性的關鍵。Oliveira等[11]認為，植物表皮水分滲透性與蠟質成分的極性有關，低極性物質能更有效的防止水分散失。但有關蠟質晶體結構與葉水分散失過程之間的關系還有待進一步研究。

紫花苜蓿在逆境脅迫下可通過葉表皮蠟質含量、成分或結構的改變而提高抗逆性[10，17-19]，轉基因苜蓿蠟質含量與抗干旱能力同樣呈正相關[20-21]。而不同品種之間蠟質含量差異與抗旱性之間的關系尚未見報道。本研究以5個苜蓿品種為材料，分析苜蓿葉表面蠟質覆蓋量以及抗性生理指標，旨在探討不同苜蓿品種葉片蠟質覆蓋量與抗旱性的關系，為選育抗旱苜蓿品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料 阿爾岡金、大富豪、WL525、苜蓿王和WL2321共5個苜蓿品種。材料種植地為廣州市仲愷農業(yè)工程學院鐘村實驗場溫室大棚。苜蓿種子經2% NaClO消毒后，在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，挑取生長狀態(tài)一致的健康小苗種植于溫室大棚中，種植土壤質地為壤土，定期澆水。自然光照，溫度為20～28 ℃，相對濕度為70%～90%。待苜蓿植株生長兩個月后，取不同苜蓿品種葉進行各項指標的測定。

1.2試驗方法

1.2.1不同苜蓿品種葉表面蠟質掃描電鏡分析和含量測定 自植株上部采集第2片展開葉片，從葉中間沿葉脈切割，分正反兩面，距中間葉脈 0.1 cm 處剪取樣品進行掃描電鏡觀察，葉片表面蠟質掃描電鏡分析的材料處理和制作參照周玲艷等[22]的方法，每個苜蓿品種分別取3枚葉片進行正反面表面蠟質掃描電鏡觀察。葉片蠟質提取參照周小云等[23]的方法，采用稱重法計算葉面積，每個苜蓿品種重復測定3次，取其平均值。

1.2.2不同苜蓿品種葉片葉綠素浸提率的測定 取1.5 g苜蓿葉片并剪碎至約3 cm長，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗條件下輕輕搖晃，分別于20、40、50、60、90、120和210 min取3 mL浸提液用于測定其在λ664和λ647波長下的吸收值，每次測定后的浸提液倒回相應的瓶中，每個品種各做3個重復。

葉綠素浸提量(mmol·g-1)=7.93A664+19.53A647；

葉綠素浸提率=(不同浸體時間的葉綠素浸提量/210 min時的葉綠素浸提量)×100%。

式中，不同浸體時間分別為20、40、50、60、90、120 min。

1.2.3脯氨酸含量測定 脯氨酸含量采用酸性水合茚酸酮法[24]測定。

1.2.4PEG模擬干旱處理 取不同苜蓿品種枝條插于質量分數為20% 的PEG-6000溶液中，25 ℃恒溫，光照強度為100～150 μmol·m-2·s-1，光照時間為14 h·d-1，觀察不同苜蓿品種生長狀態(tài)，并于處理36 h時進行拍照，重復3次。

1.3數據統(tǒng)計 試驗數據采用SPSS 17.0及Excel 2003進行分析處理。顯著水平為P<0.05(Dunman法)。

2 結果

2.1不同苜蓿品種葉片表面蠟質晶體的掃描電鏡觀察 為了考察不同苜蓿品種葉表面蠟質分布情況，本試驗采用掃描電鏡觀察苜蓿葉片。結果表明，苜蓿王和阿爾岡金葉片蠟質片狀結構大而密集；大富豪蠟質片狀結構也大，但較稀疏；WL2321和WL525葉片蠟質片狀結構小而稀疏(圖1)。

2.2不同苜蓿品種葉蠟質含量測定 5個苜蓿品種中，苜蓿王的葉表面蠟質含量最高，為0.539 mg·cm-2，大富豪、阿爾岡金和WL2321葉表面蠟質含量相差不大，約為0.50 mg·cm-2，而WL525的葉表面蠟質含量最低，只有0.402 mg·cm-2。苜蓿王與WL525葉表面蠟質含量相差顯著(P<0.05)(表1)。

2.3不同苜蓿品種葉片的葉綠素浸提率測定 隨浸提時間的增加，各苜蓿品種的葉綠素浸提率增加(圖2)。在浸提初期，苜蓿王葉綠素浸提速率較快，但到60 min以后，其葉綠素浸提速率相對其他品種明顯減慢。在5個苜蓿品種中，WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，且在90 min以內，大富豪與WL525葉片的葉綠素浸提速率差異顯著(P<0.05)。

2.4不同苜蓿品種葉片的脯氨酸含量測定 脯氨酸是一種重要的滲透調節(jié)物質，在植物抗旱性方面有著積極作用。不同苜蓿品種間的脯氨酸含量差異顯著(P<0.05)，苜蓿王的脯氨酸含量最高，為231.2 μg·g-1，其次是大富豪，為108.7 μg·g-1，再次為阿爾金剛和WL2321分別為72.9和60.9 μg·g-1，而WL525的脯氨酸含量最低，只有35.7 μg·g-1(表1)。

2.5不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理 對不同苜蓿品種的蠟質覆蓋量和生理特性的分析表明，不同苜蓿品種之間存在著差異，而表面蠟質在防止水分散失中起著非常重要的作用，可能與苜蓿植株的抗旱性有關。本研究取不同苜蓿品種枝條扦插于質量分數為20% 的PEG-6000溶液中進行模擬干旱處理，結果表明，苜蓿王萎蔫程度最低(圖3)，說明苜蓿品種抗旱能力增強可能與植株葉片蠟質覆蓋量增加有關。

3 討論與結論

植物表皮蠟質層是植物自我防護的第一道屏障，對調控表皮滲透性、減少非氣孔性水分喪失等起著重要作用[3-4]。Weng等[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥lacs1lacs2雙缺失突變體的葉綠素浸提率是野生型的4倍，失水率也比野生型高，對干旱更為敏感。Seo等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥MYB96轉錄因子突變體葉表面蠟質含量與葉綠素浸提率和角質蒸騰呈正相關。Leide等[14]的研究表明，番茄ps突變體果實表面失水率比對照快5～8倍。Vogg等[6]在對番茄蠟質研究中發(fā)現(xiàn)，蠟質組成，特別是內表皮蠟質起著蒸騰屏障的作用。郭彥軍等[19]在對苜蓿進行水分脅迫處理試驗中發(fā)現(xiàn)，強抗旱植株葉面蠟質含量明顯高于弱抗旱植株，說明葉表皮蠟質可能參與了控制水分散失的過程。本試驗掃描電鏡結果顯示，苜蓿葉表皮存在致密蠟質層，蠟質晶體結構呈片狀或梅花狀。掃描電鏡和蠟質含量測定結果表明，不同品種苜蓿葉表面蠟質含量不同，其中，苜蓿王的葉表面蠟質分布較密集，蠟質含量較高，而WL525葉表面蠟質分布較稀疏，蠟質含量較少。葉綠素浸提速率試驗表明，苜蓿王葉片在浸提后期葉綠素浸提速率相對其他品種明顯較慢，而WL525的葉綠素浸提率在不同時間段一直最大，說明不同苜蓿品種葉片表面蠟質覆蓋與表皮滲透性呈正相關，可能參與調控水分的非氣孔性喪失。

圖1 不同苜蓿品種葉表面蠟質晶體結構掃描電鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscopy analysis on structure of leaf epicuticular wax crystals of different alfalfa varieties

表1 不同苜蓿品種葉表面蠟質含量和脯氨酸含量測定Table 1 The total contents of leaf epicuticular wax and proline of different alfalfa varieties

張志飛等[5]認為，表皮蠟質含量可以作為高羊茅品種抗旱性鑒定的一個新指標。表皮蠟質含量對抗旱性的積極作用在其他多種植物的研究中已得到驗證，如Bourdenx等[8]在過表達擬南芥蠟質合成相關基因CER1研究中發(fā)現(xiàn)，轉CaMV35S::CER1擬南芥植株角質層通透性比野生型和突變體的低，對干旱脅迫有更強的耐受力。Islam等[9]通過對蠟質合成相關基因OsGL1-2的過表達發(fā)現(xiàn)，蠟質的積累可增強水稻對干旱的抗性。Zhang等[20]將豆科植物的一個轉錄因子WXP1基因轉入苜蓿中，轉基因植株葉單位面積的蠟質含量增加，抗旱性提高，而WXP1及WXP2轉化擬南芥同樣提高了其蠟質含量和抗水分脅迫的能力[21]。本研究通過質量分數為20% 的PEG-6000溶液進行模擬干旱脅迫，結果表明，蠟質含量最高的苜蓿王對干旱的敏感性最弱，說明苜?？赡芡ㄟ^蠟質層的增厚而減少蒸騰來限制水分散失，增強植株抗旱能力。

圖2 不同苜蓿品種的葉綠素浸提率分析Fig.2 The Chlorophyll leaching assays of mature leaves from different alfalfa varietiess

圖3 不同苜蓿品種的PEG模擬干旱處理Fig.3 The simulated drought treatment of different alfalfa varieties

植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸[26]。逆境條件下，植物體內脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸積累量與抗旱性呈正相關[19,26-27]。本研究對5個苜蓿品種葉片脯氨酸含量測定表明，苜蓿王葉片脯氨酸含量最高，而WL525葉片脯氨酸含量最低。說明苜蓿也可能通過滲透調節(jié)來限制水分散失。

本試驗通過對苜蓿葉片表面蠟質覆蓋觀察和蠟質含量的測定以及抗旱生理和抗旱性分析，結果表明，苜蓿品種葉片表面蠟質覆蓋與抗旱性存在一定的正相關性，可為抵抗各種生物和非生物脅迫的角質層蠟質基因在苜蓿品種的抗性改良和選育提供新途徑和參考指標。

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