肝癌石蠟標(biāo)本免疫組化染色常見問題及對(duì)策*

林麗琳，翁劍武，張心妤，王 鳳，黃秀清，謝 群

(莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院，福建莆田 351100)

技術(shù)方法

肝癌石蠟標(biāo)本免疫組化染色常見問題及對(duì)策*

林麗琳，翁劍武，張心妤，王 鳳，黃秀清，謝 群△

(莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院，福建莆田 351100)

肝細(xì)胞癌;免疫組織化學(xué);內(nèi)源性生物素;抗原修復(fù);石蠟標(biāo)本

1 切片技術(shù)

1.1 存在問題 臨床上HCC石蠟標(biāo)本在鏡下?？梢姼伟┙M織、肝組織纖維化、脂肪變性、正常肝組織等表現(xiàn)。因此，HCC組織切片形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組織質(zhì)地不一。通常表現(xiàn)較為堅(jiān)硬，導(dǎo)致切片難度較大，切片易出現(xiàn)裂縫、缺口、皺褶等，給切片帶來一定難度。

1.2 解決辦法

1.2.1 蠟塊預(yù)冷:將石蠟包埋組織塊預(yù)先放入-20℃冰凍30min左右，時(shí)間應(yīng)適度，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使蠟塊出現(xiàn)龜裂，冰凍過短則整個(gè)蠟塊致冷不均勻、不充分，會(huì)出現(xiàn)切片不平整;切片過程中若組織塊溫度回升，應(yīng)及時(shí)用冰塊冷敷1-2min，并用拇指蘸冰水撫平組織塊;夏季室溫高則輔以空調(diào)降低室溫。這些措施均可有效保證切出平整的切片。

1.2.2 修片和切片:刀片鈍、有缺口可致切片出現(xiàn)裂縫等，修片過程中建議使用刀片固定的一個(gè)位置專門修片，修片后切片時(shí)應(yīng)換到修片位置相鄰的部位，這樣讓切片在未修片位置的鋒利刀口處進(jìn)行，保證切片平整，同時(shí)還可以減少刀片的損耗。我院實(shí)驗(yàn)室切片中發(fā)現(xiàn)HCC中癌變合并脂肪肝病變時(shí)組織切片極易損耗刀片，切片時(shí)應(yīng)及時(shí)更換新刀片，可避免因刀片原因?qū)е碌那衅押鄣痊F(xiàn)象。在切片過程中要注意用力均勻，避免切片厚薄不均。

2 抗原修復(fù)

2.1 存在問題 不同肝癌細(xì)胞抗原在細(xì)胞中的定位存在差異，抗原修復(fù)的難易程度不一。實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)三種情況:一是肝癌細(xì)胞抗原修復(fù)無法使抗原充分暴露，出現(xiàn)假陰性結(jié)果(圖1A);二是抗原修復(fù)可以暴露抗原，也可使原被甲醛封閉的內(nèi)源性生物素活化，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室在采用EDTA(pH=9.0)，SP法時(shí)就出現(xiàn)過明顯的假陽性結(jié)果(圖1B)，胞質(zhì)中可見均勻的棕色顆粒，與李雯等的報(bào)道一致[2];三是肝癌組織采用雙修復(fù)法，即檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)高溫高壓修復(fù)法加胰蛋白酶修復(fù)法，導(dǎo)致消化處理過度，組織結(jié)構(gòu)破壞(圖1C)。

圖1 HCC抗原修復(fù)不良的三種后果

2.2 解決辦法

2.2.1 抗原修復(fù)方法的選擇:如果已知抗原定位，可以先了解常用的抗原修復(fù)方法，以提高預(yù)實(shí)驗(yàn)的陽性率。一般來說，胞膜抗原建議微波加熱修復(fù)法;胞核抗原修復(fù)難度較大，幾乎都需要高溫高壓修復(fù)，修復(fù)液應(yīng)選擇檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)[3]。EDTA(pH=8.0/9.0)適合于大多數(shù)抗原修復(fù)，特別是對(duì)于定位于胞核和較難表達(dá)的抗原效果較好[4-5]。胰蛋白酶主要用于修復(fù)定位于胞內(nèi)的抗原，胃蛋白酶消化力較前者強(qiáng)，主要用于修復(fù)細(xì)胞間質(zhì)抗原[6]。

2.2.2 阻斷內(nèi)源性生物素:肝組織含有較豐富內(nèi)源性生物素，加熱抗原修復(fù)活化后可與卵白素或鏈酶卵白素結(jié)合，因而基于(鏈菌)抗生物素蛋白檢測(cè)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)方法(如SP法)易出現(xiàn)假陽性[7]。因此，可通過使用外源性抗生物素蛋白阻斷內(nèi)源性生物素來消除其影響，或使用非生物素監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

2.2.3 條件控制:肝癌組織使用酶修復(fù)法應(yīng)注意37℃孵育的時(shí)間，一般為15min，可根據(jù)免疫組化染色鏡下觀察，并與HE的組織形態(tài)比較，判斷是否過度消化組織。若發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)破壞，薄且較透明，染色較淺時(shí)，可以考慮縮短酶孵育時(shí)間。

3 非特異性染色情況的分析與對(duì)策

①肝組織含有膽色素可影響免疫組化染色[8]。而肝組織中的Kupffer細(xì)胞和肝癌細(xì)胞可能會(huì)吞噬抗原等異物，應(yīng)注意鑒別判斷。建議通過陰性對(duì)照片和HE染色鑒別。②肝內(nèi)有豐富的肝血竇，貯藏大量的血液，因此，肝癌組織易發(fā)生出血、壞死，細(xì)胞自溶釋放出各種蛋白或多肽片斷與抗體發(fā)生非特異染色，嚴(yán)重壞死的肝癌組織染色后呈均勻黃染(圖2)。建議盡量選用壞死、出血情況輕微的肝癌組織[9-11]。

4 假陽性原因分析與對(duì)策

4.1 原因分析 生物素是參與糖異生和脂肪酸合成反應(yīng)的輔酶之一，產(chǎn)生的主要部位是腸道。人體內(nèi)主要分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，故代謝旺盛、線粒體豐富的細(xì)胞中生物素含量高，如肝臟、腎臟、乳腺、結(jié)腸組織，廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織等[7,12]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性生物素位于細(xì)胞胞漿中，呈現(xiàn)均勻的顆粒狀染色(圖3)。腫瘤細(xì)胞中含有豐富的線粒體，故內(nèi)源性生物素含量很高。在同一組織器官不同類型的腫瘤中，內(nèi)源性生物素表達(dá)水平可能會(huì)有差異[13-15]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，內(nèi)源性生物素在正常肝組織、肝硬化組織及肝癌組織中都有分布,主要以顆粒狀形式存在于胞質(zhì)中,容易造成非特異性顯色[16]。而各種肝臟病變對(duì)肝臟代謝能力的影響有所不同，肝癌組織不同切片所含內(nèi)源性生物素存在差異，不同層次的組織切片相距愈遠(yuǎn)，組織形態(tài)差異愈大，組織表達(dá)生物素水平差異也愈大。原來被甲醛等固定液封閉的內(nèi)源性生物素經(jīng)加熱抗原修復(fù)重新暴露出來，可使(鏈菌) 抗生物素蛋白檢測(cè)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)方法(如SP、SABC和LSAB法)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，勢(shì)必影響結(jié)果判定[7,12]。

圖3 肝癌組織內(nèi)源性生物素表達(dá)強(qiáng)陽性(SP法)

4.2 對(duì)策 ①蛋清封閉法[7,12]:使用新鮮蛋清稀釋成15%-30%蛋清液，在一抗孵育后室溫孵育30min，封閉效果有較高的濃度依賴性，需經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適合的濃度。封閉前后應(yīng)用蒸餾水充分洗滌,PBS漂洗3次×3min，防止產(chǎn)生非特異染色。內(nèi)源性生物素先與蛋清液中含有抗生物素的蛋白結(jié)合，封閉了內(nèi)源性生物素樣分子的結(jié)合位點(diǎn)，避免了內(nèi)源性生物素與SP、SABC、LSAB檢測(cè)系統(tǒng)中抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白的結(jié)合,從而消除內(nèi)源性生物素的非特異性干擾。經(jīng)過合適的閉后使用生物素標(biāo)記的系統(tǒng)可以取得理想結(jié)果，該檢測(cè)系統(tǒng)可作為首選方法之一[12]。②生物素阻斷系統(tǒng)[10]:使用卵白素進(jìn)行封閉，但研究表明有的封閉液不能達(dá)到滿意的封閉效果[12]。③非生物素檢測(cè)系統(tǒng)Polymer兩步法[11,17]:如Envision、EliVision檢測(cè)系統(tǒng)能有效避免內(nèi)源性生物素的干擾。④嚴(yán)格制備陰性對(duì)照片。以上方法都應(yīng)堅(jiān)持使用陰性對(duì)照，而且建議采用連續(xù)切片，切片組織形態(tài)相近，有較高的可比性。

5 假陰性分析與對(duì)策[18]

5.1 抗原丟失 一般切片室溫保存3-6月后會(huì)出現(xiàn)不同程度的抗原丟失。對(duì)于已切好的石蠟切片貯藏時(shí)間不應(yīng)太長(zhǎng)且應(yīng)做好時(shí)間記錄，在有效時(shí)間內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)于可疑抗原丟失的，可用石蠟切片(新鮮切片)來驗(yàn)證。

5.2 抗原修復(fù) 修復(fù)不全或無效，抗原決定簇暴露不全。進(jìn)行有效的抗原修復(fù),EDTA(pH=8.0/9.0)適合于大多數(shù)抗原修復(fù)，特別對(duì)于定位于胞核和較難表達(dá)的抗原效果較好。

5.3 抗體與組織結(jié)合 內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑可能會(huì)影響抗體與組織的結(jié)合。阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶是使用3%過氧化氫與內(nèi)源性過氧化氫酶反應(yīng)，防止內(nèi)源性過氧化氫酶催化底物，使DAB顯色。而正確的反應(yīng)是DAB與連接在抗原抗體上過氧化氫酶反應(yīng)，定位在細(xì)胞抗原部位。內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷步驟應(yīng)放在DAB顯色之前操作，在其它可能問題都排除的情況下，可以考慮將此步驟放在一抗孵育后。

綜上所述，癌組織的免疫組化染色在HCC診斷中的作用愈來愈重要，同時(shí)關(guān)于HCC發(fā)病機(jī)理與轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究也是熱點(diǎn)之一，免疫組化染色在醫(yī)學(xué)科研中的使用率也是居高不下。因此，臨床診斷人員與科研工作者應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到HCC免疫組化染色的重要性，控制好實(shí)驗(yàn)條件，嚴(yán)格要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，預(yù)防和糾正實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題，重視每個(gè)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真的因素，謹(jǐn)慎分析免疫組化結(jié)果，避免出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，從而提高病理診斷與科學(xué)研究的準(zhǔn)確率，為HCC防治提供正確的指導(dǎo)。

[1]Parkin DM, Bray F, Ferlay S, et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108.

[2]李雯,梁顏笑,劉國(guó)榮,等.不同抗原修復(fù)方法對(duì)肝癌組織中內(nèi)源性生物素的影響及對(duì)策[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2005,14(4):462-465.

[3]王曉秋.免疫組化染色前抗原修復(fù)方法的合理選擇[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(3):367-368.

[4]李科,楊紅,徐剛.不同抗原修復(fù)液對(duì)免疫組化結(jié)果的影響[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2006,15(1):110-112.

[5]廖德貴,黃世章.不同抗原修復(fù)方法對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2009,16(3):62-65.

[6]李飛虹,高嵋.研究生應(yīng)用免疫組化技術(shù)的質(zhì)控與標(biāo)準(zhǔn)化[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,26(2):218-220.

[7]王永軍,王珩,王小玲,等.內(nèi)源性生物素對(duì)免疫組化染色的影響及消除方法[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2005,12, 21(6):735-736.

[8]韓永,楊敏,李樹林,等.快速消除膽色素在肝組織免疫組化檢測(cè)中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2007,23(2): 229-230.

[9]鄧汝東.免疫組化染色的體會(huì)[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,7(2):109.

[10]周小鴿.免疫組織化學(xué)染色的干擾因素及其處理[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2006,22(4):389-391.

[11]鄭暉,羅洪英,顏亞暉.免疫組織化學(xué)技術(shù)常見問題分析及對(duì)策[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,16(1):126-127.

[12]高春,王愛英,韓亞京.內(nèi)源性生物素在結(jié)腸組織中的表達(dá)及其對(duì)免疫組化的影響[J].世界華人消化雜志,2008,16 (5):551-555.

[13]嚴(yán)超,朱正綱,于穎彥,等.加熱抗原修復(fù)對(duì)胃癌組織中內(nèi)源性生物素樣分子活性的影響[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2004, 4(2):170-172.

[14]潘紅,周小鴿,張彥寧.內(nèi)源性生物素在腎腫瘤中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].診斷病理學(xué)雜志,2005,12(3):199-201.

[15]廉瑩,李靜,黃燕紅,等.乳頭狀甲狀腺癌與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫內(nèi)源性抗生物素蛋白結(jié)合活性表達(dá)比較研究[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2012,32(6):466-468.

[16]侯巧燕,陳罡,張美艷.消除肝組織免疫組化中非特異性顯色的探討[J].華夏醫(yī)學(xué),2005,18(1):6-7.

[17]楊建法,潘登,趙雨來.石蠟切片系列肝纖維化相關(guān)指標(biāo)免疫組織化學(xué)檢測(cè)中的抗原修復(fù)探討[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2005,30(7):656.

[18]涂倩.DAB染色中的兩個(gè)問題及對(duì)策[J].診斷病理學(xué)雜志，2011,18(5):400.

R-331

A

1004-6879(2013)06-0506-03肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)約占原發(fā)性肝癌的90%，在全球范圍發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，在我國(guó)僅次于肺癌和胃癌[1]。免疫組織化學(xué)技術(shù)是HCC臨床病理診斷中最重要的技術(shù)手段之一，且廣泛應(yīng)用于HCC科學(xué)研究領(lǐng)域。然而，由于HCC標(biāo)本病理學(xué)形態(tài)多樣化、病變組織質(zhì)地較硬及富含內(nèi)源性生物素等因素，導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)操作中特異性染色不佳，假陽性及假陰性等現(xiàn)象頻發(fā)，大大影響了臨床診斷與科研檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，選擇正確合理的抗原修復(fù)方法以及排除非特異染色是極其重要的環(huán)節(jié)。

2013-05-28)

* 福建省教育廳資助省屬高?？蒲袑ｍ?xiàng)(JK類)項(xiàng)目(JK2011050)

△ 通訊作者