丹參酮對(duì)兔急性心梗再灌注損傷的心肌保護(hù)

章慧慧，黃抒偉，王琳莉，林冬銘

(1.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，杭州 311100；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，杭州 310005)

丹參酮對(duì)兔急性心梗再灌注損傷的心肌保護(hù)

章慧慧1,2，黃抒偉2*，王琳莉2，林冬銘2

(1.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院，杭州 311100；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，杭州 310005)

目的 探討丹參酮在心肌梗死再灌注損傷中的干預(yù)作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 將40只，♂，新西蘭大白兔按成組設(shè)計(jì)應(yīng)用隨機(jī)列表法分成4組，每組10只：葡萄糖再灌注組、丹參酮再灌注治療組、丹參酮冠脈結(jié)扎前治療組和假手術(shù)組。建立再灌注模型后經(jīng)耳緣靜脈給藥。分別于結(jié)扎前5 min、結(jié)扎后1 h、再灌注后2 h時(shí)，取血清檢測(cè)肌酸激酶(CK)、肌酸激酶的同功酶(CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)。并于再灌注后2 h，以1%的四氮唑紅溶液制作心肌切片，以AutoCAD 2002圖形設(shè)計(jì)軟件計(jì)算壞死心肌范圍。結(jié)果 ①丹參酮再灌注組與葡萄糖再灌注組、丹參酮結(jié)扎前治療組與葡萄糖再灌注組在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；丹參酮再灌注組與丹參酮結(jié)扎前治療組在再灌注后2 h的CK、CK-MB無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)、Tn-Ⅰ有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。②丹參酮再灌注組與葡萄糖再灌注組、丹參酮結(jié)扎前治療組與葡萄糖再灌注組心肌梗死范圍比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。丹參酮再灌注組與丹參酮結(jié)扎前治療組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論 靜脈注射丹參酮可以降低兔急性心肌梗死再灌注后CK、CK-MB、Tn-Ⅰ，并減少兔急性心肌梗死面積。

丹參酮；心肌缺血再灌注損傷；心肌保護(hù)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury)是指在心肌缺血一段時(shí)間后，再次恢復(fù)血供后發(fā)生的更為嚴(yán)重的損傷，可以導(dǎo)致缺血面積擴(kuò)大、無復(fù)流(no-reflow phenomenon，NR)、心肌頓抑和再灌注心律失常等。目前，心肌缺血再灌注損傷越來越受到人們重視，對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制還沒有完全清楚。丹參酮作為我國的傳統(tǒng)中藥，在治療心腦血管病方面有著很好的效果，已有多項(xiàng)研究顯示丹參酮具有抗炎、抗血小板、抗血栓形成、緩解心絞痛以及抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過結(jié)扎冠脈建立急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型，評(píng)價(jià)AMI再灌注后心肌梗死面積以及血液學(xué)指標(biāo)的變化，探討丹參酮對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康新西蘭大白兔40只，♂，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2008-0036。

1.1.2 藥品 丹參酮針劑(上海第一生化藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL︰10 mg，批號(hào)：100722)；葡萄糖注射液(杭州民生藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：21011121)。

1.1.3 生化試劑與檢測(cè)儀器 磷酸肌酸激酶(CK) (生產(chǎn)商：廣州標(biāo)佳，批號(hào)：103111)；肌酸激酶的同功酶(CK-MB)(生產(chǎn)商：英國朗道公司，批號(hào)：CK1553)；肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)(生產(chǎn)商：美國BioMerieux，批號(hào)：1000498140)。

檢測(cè)儀器：UniCel DxC800全自動(dòng)生化分析儀(BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組 將40只新西蘭大白兔，♂，按成組設(shè)計(jì)應(yīng)用隨機(jī)列表法分成4組，每組10只。以3%戊巴比妥鈉1.1 mL·kg-1經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，沿胸骨正中開胸，保持胸膜完整，將結(jié)扎線圈內(nèi)置入硅膠管結(jié)扎左室緣支1 h，以心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上抬高2 mm為結(jié)扎有效，再松解2 h建立AMI及再灌注模型，假手術(shù)組只繞冠狀動(dòng)脈左室緣支穿線，不結(jié)扎。4組分別經(jīng)耳緣靜脈給藥：葡萄糖再灌注組為對(duì)照組，再灌注前10 min緩慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1；丹參酮再灌注治療組，再灌注前10 min耳緣靜脈緩慢注射丹參酮ⅡA磺酸鈉5.0 mg·kg-1溶于25%葡萄糖注射液1 mL·kg-1中；丹參酮冠脈結(jié)扎前治療組，結(jié)扎前30 min耳緣靜脈緩慢注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，劑量同丹參酮再灌注治療組；假手術(shù)組，再灌注前10 min由耳緣靜脈緩慢注射25%的葡萄糖注射液2 mL·kg-1。

1.2.2 血清樣本制備方法 分別于結(jié)扎前5 min、結(jié)扎后1 h、再灌注后2 h，從頸總動(dòng)脈取血4 mL，放入低溫離心機(jī)中，3 500 r·min-1離心，10 min后取血清，-70 ℃保存。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)方法 取制備好的血清樣本，使用UniCel DxC800全自動(dòng)生化分析儀(BECKMAN公司)對(duì)CK、CK-MB 以及Tn-Ⅰ濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 心肌梗死范圍的測(cè)定 再灌注120 min后，立即取出心臟，沿心臟長(zhǎng)軸分為5～6心肌短軸切片，再將整個(gè)心肌切片放入1%的四氮唑紅(triphen yltetrazoliumchloride，TTC)溶液(pH 7.4)中，37 ℃孵箱中孵化15 min，梗死心肌不著色，非梗死部位心肌呈磚紅色，對(duì)切片進(jìn)行拍照。將錄像中各個(gè)斷面圖像輸入計(jì)算機(jī)，以Image-Pro Plus 6.0 圖象處理軟件計(jì)算各斷面左心室室壁心肌面積(left ventricular myocardial area，LVMA)、梗死區(qū)心肌面積(myocardial infraction area，MIA)，以MIA與LVMA之比作為壞死心肌范圍(MIA/LVMA/%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各檢測(cè)點(diǎn)組間血清學(xué)指標(biāo)比較

與葡萄糖再灌注組比較，丹參酮再灌注組和丹參酮結(jié)扎前治療組在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ顯著減小，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。假手術(shù)組與其他3組比較，在再灌注后2 h的CK、CK-MB、Tn-Ⅰ均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組兔CK、CK-MB、Tn-Ⅰ測(cè)定結(jié)果(n=10)Tab 1 The results of CK, CK-MB, Tn-Ⅰ(n=10)

2.2 冠脈結(jié)扎組間新西蘭大白兔心肌梗死范圍比較

與葡萄糖再灌注組比較，丹參酮再灌注組和丹參酮冠脈結(jié)扎前治療組的心肌梗死范圍明顯減小(P＜0.05)，丹參酮再灌注組與丹參酮結(jié)扎前治療組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果見表2和圖1。

表2 3組冠脈結(jié)扎組心肌梗死范圍(n=10)Tab 2 The area of myocardial infarction(n=10)

圖1 各組心肌梗死面積(不著色為梗死區(qū)域)A-葡萄糖再灌注組；B-丹參酮再灌注組；C-丹參酮結(jié)扎前治療組；D-假手術(shù)組Fig 1 The area of myocardial infarction(no coloring)A-glucose reperfusion group; B-tanshinone reperfusion group;C-tanshinone pre-blocking treatment group; D-sham-operation group

3 討論

3.1 心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制

心肌缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理過程，其概念是在1960年由Jennings首先提出。心肌細(xì)胞發(fā)生缺血后，如果時(shí)間短，心肌尚處于可逆損傷的狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞的損傷呈進(jìn)行性加重，當(dāng)血供恢復(fù)后，缺血組織功能未能恢復(fù)甚至惡化，Moens等[1]認(rèn)為心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制可能是氧自由基生成、鈣超載和白細(xì)胞激活。其再灌注后發(fā)生的損傷不僅包括組織器官的代謝紊亂、功能障礙，也包括組織結(jié)構(gòu)的破壞。其臨床后果有：①再灌性心肌頓抑(myocardial stunning)，即指心肌缺血再灌注后，心肌的力學(xué)功能需經(jīng)一定時(shí)間，有時(shí)數(shù)天甚至數(shù)周后才能恢復(fù)；②再灌注性心律失常(reperfusion arrhythemia)，主要為室性期前收縮或室性心動(dòng)過速；③心肌酶及鈣蛋白亞單位漏出，心肌酶包括CK、乳酸脫氫酶以及心肌特有的CK同工酶，通過測(cè)定血清中這些酶升高的程度可反映心肌損害的程度。Tn-Ⅰ是心肌特有的抗原，對(duì)心肌損傷具有高度的特異性和敏感性，是反映IRI的敏感指標(biāo)。

3.2 丹參酮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

丹參酮(tanshinone)是中藥丹參根的乙醚或乙醇提取物，其含有的醌類成分參與生物體內(nèi)多種生化效應(yīng)，在體內(nèi)可表現(xiàn)出多種生物活性。其對(duì)缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用可能通過以下機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

3.2.1 清除氧自由基，減少心肌細(xì)胞的損傷 已有實(shí)驗(yàn)證明[2]心肌缺血時(shí)心肌氧自由基大量產(chǎn)生，清除氧自由基的酶SOD活性下降，導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)堆積，破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成了心肌細(xì)胞損害。本實(shí)驗(yàn)中使用丹參酮治療心肌梗死大白兔，結(jié)果表明心肌酶的溢出明顯減少，可能與提高心肌組織缺血后SOD的活力，增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除，減輕了缺血再灌注區(qū)組織細(xì)胞的損傷有關(guān)[3]，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

3.2.2 鈣通道阻滯作用，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載 細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是心肌細(xì)胞損傷和不可逆壞死的共同通路，故降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是防止或者減少心肌損傷的重要手段。孫學(xué)剛等[4]通過觀察發(fā)現(xiàn)丹參酮可引起心肌細(xì)胞出現(xiàn)超級(jí)化轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞外鈣內(nèi)流減少，通過防止心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載而減輕心肌缺血后發(fā)生的再灌注損傷。研究還顯示丹參酮能減少缺氧引起的線粒體鈣內(nèi)流，減少缺血再灌注損傷過程中，鈣超載導(dǎo)致的ATP酶激活引起的ATP耗竭，從而保護(hù)線粒體。丹參酮是否通過鈣通道阻滯作用使心肌細(xì)胞膜電位維持在正常水平，從而具有保護(hù)心肌的作用，值得做進(jìn)一步的研究。

3.2.3 擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈側(cè)枝血管，改善微循環(huán)，縮小心肌梗死面積 目前，多數(shù)人認(rèn)為微循環(huán)障礙是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，主要原因可能為毛細(xì)血管內(nèi)皮的破壞以及微血栓或小動(dòng)脈血栓形成。裴非等[5]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸能使原缺血部位心肌毛細(xì)血管墨汁灌流數(shù)明顯增加，有效改善IR冠脈微循環(huán)缺血部位的血液灌流，縮小無復(fù)流面積。劉啟功等[6]實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參注射液能促進(jìn)冠脈側(cè)枝循環(huán)的開放和形成，并認(rèn)為前者可能與其冠脈擴(kuò)張作用有關(guān)，后者可能與丹參能使心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)上調(diào)有關(guān)。張潔等[7]發(fā)現(xiàn)丹參酮對(duì)原代培養(yǎng)豬冠脈平滑肌上ATP敏感的鉀通道和鈣激活鉀通道均有直接激活作用，并由此推測(cè)可能由于上述通道的開放協(xié)同鈣通道阻滯作用可引起冠脈舒張，改善冠脈平滑肌的功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)的研究顯示使用丹參酮治療后，與對(duì)照組大白兔的心肌梗死面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，支持這種推測(cè)，其具體機(jī)制有待更多深入的研究。

REFERENCES

[1] MOENS A L, CLAEYS M J, TIAMERMAUS J P. Myocardial ischemia/reperfusion - injury, a clinical view on a complex pathophysiological process [J]. Int J Cardiol, 2005, 100(2): 179-190.

[2] GUO Q, CHEN S Y, YAO X J, et al. Protective effect of corocinnarine on ischemia - reperfusion myocardium of rats and its relation to anti-lipid peroxidation [J]. Chin Heart J(心臟雜志), 2002, 14(1): 4-6.

[3] XU C Y, YANG J R, LIU X P, et al. Effects of Danshen glucose injection on the biochemical indexes in dogs by coronary artery ligation [J]. Chin J Exp Tradit Med Form(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志), 2006, 12(2): 43-45.

[4] SUN X G, JIA Y H, ZHANG L H. Effect of tanshinone of intracellular free catantial in normal and hypoxia myocytes of rats [J]. Chin J Inf Tradit Chin Med(中國中醫(yī)藥信息雜志), 2002, 9(9): 21-23.

[5] PEI F, FAN B J, ZHAO X J. Effects of compound Danshen dripping pills on myocardial microcirculation after myocardial ischemia reperfusion injury of rats [J]. Chin J Gerontol(中國老年學(xué)雜志), 2008, 28(23): 2316-2317.

[6] LIU Q G, SUN Y M, CHEN Y X, et al. Restrictive effect of Salvia miltiorrhiza on myocardial infarct area in dogs and its possible mechanism [J]. China J Mod Med(中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志), 2005, 15(15): 2257-2259.

[7] ZHANG J, ZENG X R, YANG Y, et al. Effect of sodium tanshinone ⅡA on KATP, BKCa of coronary artery smooth muscle of primary porcine cells [J]. J Luzhou Med Coll(瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)), 2000, 23(3): 177-179.

Myocardium Protection of Tanshinone on Ischemia Reperfusion Injury of Rabbits with Acute Myocardial Infarction

ZHANG Huihui1,2, HUANG Shuwei2*, WANG Linli2, LIN Dongming2
(1.First People’s Hospital of Yuhang District, Hangzhou 311100, China; 2.Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medicine University, Hangzhou 310005, China)

OBJECTIVE To explore the effect of tanshinone on ischemia reperfusion injury of rabbits after acute myocardial infarction, and to supply the experimental proof for the clinic. METHODS Divide 40 male rabbits into 4 groups, 10 per group: glucose reperfusion group, tanshinone reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and sham-operation group. Reperfusion injury model was established and the drug was administrated intravenously. Blood was collected to test the CK, CK-MB, Tn-Ⅰ at the time of 5 min pre-blocking, 1 h post-blocking and 2 h post reperfusion. 1% Triphenyltetrazolium chloride was used to produce myocardial incision. AutoCAD 2002 software was applied to calculate the area of myocardial infarction. RESULTS ①Tanshinon e reperfusion group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences in CK, CK-MB, Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). Tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences in CK, CK-MB after 2 h reperfusion(P＞0.05), and had significant differences in Tn-Ⅰ after 2 h reperfusion(P＜0.05). ②The area of myoc ardial infarction between tanshinone reperfusion group and glucose reperfusion group, tanshinone pre-blocking treatment group and glucose reperfusion group had significant differences(P＜0.05). The area of myocardial infarction between tanshinone reperfusion group and tanshinone pre-blocking treatment group had no significant differences(P＞0.05). CONCLUSION Tanshinone can lower CK, CK-MB, Tn-Ⅰ of rabbits with acute myocardial infarction, and can decrease the area of myocardial infarction.

tanshinone; ischemia reperfusion injury; myocardium protection

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1062-05

2013-03-29

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009CA038)

章慧慧，女，碩士 Tel: 15905712748 E-mail: zhhzju@163.com*

黃抒偉，男，碩士，主任醫(yī)師，碩導(dǎo) Tel: 13957121104 E-mail: shuwei@hotmail.com