疏乳消塊方不同溶媒提取物對大鼠乳腺增生的治療作用

段好剛，魏玉輝，李波霞，秦紅巖，武新安

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000)

疏乳消塊方不同溶媒提取物對大鼠乳腺增生的治療作用

段好剛，魏玉輝，李波霞，秦紅巖，武新安*

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000)

目的 觀察疏乳消塊方的水、50%乙醇，95%乙醇提取物對大鼠乳腺增生的治療作用，確定提取物藥效。方法 制備乳腺增生模型大鼠，分別灌胃給予疏乳消塊方水、50%乙醇，95%乙醇提取物，采用照相顯微鏡觀察乳腺組織病理變化，并觀察乳頭的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 水提物低、中、高劑量對乳腺增生大鼠均有明顯治療作用，50%醇提物高劑量有治療作用，95%醇提物低、中、高劑量治療作用均不明顯。結(jié)論 疏乳消塊方的主要藥效提取物為水提物。

疏乳消塊方；乳腺增生；藥效提取物

疏乳消塊方由柴胡、當(dāng)歸、香附、元胡、皂刺、鱉甲、山慈菇、茯苓、白術(shù)、郁金、肉蓯蓉、淫羊藿十二味中藥組成，具有疏肝解郁、軟堅散結(jié)之功效，用于治療乳腺增生、乳痛等癥[1]。該制劑是蘭州大學(xué)第一醫(yī)院協(xié)定處方(甘藥制字Z04000808)，臨床應(yīng)用40多年已取得了較好的臨床療效。在前期研究中[2]，明確了疏乳消塊丸對大鼠乳腺增生的治療作用，并探討了其作用機制。但該制劑制備工藝是處方藥材粉碎后，以蜂蜜煉制成為大蜜丸，劑型較落后，患者服用不便。為進一步開發(fā)該制劑，本研究考察了疏乳消塊處方不同溶媒提取物對乳腺增生大鼠的治療效果，初步確定疏乳消塊處方主要藥效提取物，為疏乳消塊方的新劑型研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 動物

Wistar大鼠，SPF級，♀，未孕，體質(zhì)量180～220 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2009-0004。

1.2 藥品與試劑

疏乳消塊方不同溶媒提取物，由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科提供。苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)，批號：090802，1 mL∶1 mg)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥司，批號：080103，1 mL ∶20 mg)；乳癖消片(遼寧好護士藥業(yè)，批號：100113，0.32 g·片-1)；甲醛為分析純。

1.3 儀器

ARA520電子分析天平(美國Ohaus公司)；H2050R低溫離心機(長沙湘儀離心儀器有限公司)；CM1950全自動石蠟切片機(德國，LEICA公司)；Olympus(BX-50)照相顯微鏡。

2 方法

2.1 疏乳消塊丸處方不同溶媒提取物的制備

疏乳消塊方不同溶媒提取物由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科制備，按疏乳消塊方組方，稱取處方藥材，分別加12倍量水、50%乙醇及95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮干燥后計算提取率，結(jié)果分別為24.9%，19.8%及17.2%。

2.2 乳腺增生病模型的制備

健康未孕大鼠，♀，體質(zhì)量180～220 g，在實驗條件下飼養(yǎng)一周后，肌肉注射給予苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg·kg-1，1次·d-1，連續(xù)給藥25 d；再肌肉注射給予黃體酮注射液4 mg·kg-1，1次·d-1，連續(xù)給藥5 d。觀察大鼠乳頭外觀，測量乳頭高度及直徑，并隨機抽取5只大鼠處死，取乳腺做病理切片，判斷模型是否成功。

2.3 分組及給藥

選取模型成功的大鼠按乳頭高度及體質(zhì)量隨機分為11組，即模型組、乳癖消組(陽性對照)、水提物低、中、高劑量組、50%醇提物低、中、高劑量組、95%醇提物低、中、高劑量組，另取正常大鼠做正常組。根據(jù)提取率和疏乳消塊丸人給藥劑量，計算不同溶媒提取物大鼠的給藥劑量。不同溶媒提物低劑量組以人用劑量計算大鼠等效劑量，中劑量、高劑量分別以2倍量遞增。低、中、高劑量組分別按生藥0.86，1.72，3.44 g·kg-1·d-1，每日分2次灌胃；正常組與模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水，2次·d-1，連續(xù)30 d。乳癖消組灌胃給予乳癖消片1.0 g·kg-1·d-1，2次·d-1，連續(xù)30 d。

2.4 指標(biāo)測定

2.4.1 大鼠乳房外觀的變化 給藥結(jié)束后，觀察乳頭顏色以及乳暈大小、顏色，用游標(biāo)卡尺精確測量各組大鼠左右兩側(cè)第2對乳頭直徑及高度。

2.4.2 乳腺組織病理學(xué)觀察 給藥結(jié)束后，處死大鼠，摘取右側(cè)第2對乳頭，甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，制做病理切片，觀察乳腺組織病理變化。病理組織學(xué)觀察指標(biāo)：病理組織學(xué)專家結(jié)合文獻報道[3]，制定大鼠乳腺增生病變的診斷和分級標(biāo)準(zhǔn)。診斷標(biāo)準(zhǔn)：乳腺組織中小葉數(shù)量增多，體積增大；小葉內(nèi)腺泡擴大，管腔內(nèi)有分泌物；腺上皮細胞肥大，胞漿透亮；各級導(dǎo)管增生延長、擴張，甚至呈囊性，腔內(nèi)有數(shù)量不等的分泌物；導(dǎo)管上皮增生呈乳頭狀和(或)細胞核濃染、異型和(或)大汗腺樣化生。具體乳腺增生病變分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.4.3 體質(zhì)量及臟器指數(shù)變化 各組大鼠給藥30 d后處死，分別測定體質(zhì)量、胸腺、脾臟和子宮重量，按以下公式計算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g) /體質(zhì)量(100 g)。

2.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有計數(shù)資料均以±s 表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析；對乳腺的病理學(xué)檢查結(jié)果采用等級資料的秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠乳頭外觀及高度變化

正常組大鼠隔毛看不見乳頭位置，將毛分開后可見大鼠乳頭呈小米粒樣，緊貼在皮膚上，較柔軟，不見乳暈，整個乳房呈白色。模型組大鼠乳頭豎起、較堅實、充血、增高、隆起，有乳暈，呈深紫紅色，隔毛可見。乳癖消組多數(shù)大鼠乳頭豎起，增高，有乳暈，呈淺紅色，個別大鼠乳頭接近正常大鼠；與正常組相比，模型組大鼠的乳房直徑和乳頭高度顯著增大(P＜0.05)；與模型組大鼠相比，水提物各組大鼠乳房直徑、乳頭高度明顯減小(P＜0.05或P＜0.01)；50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1組大鼠乳房直徑、乳頭高度，有顯著差異(P＜0.05)，而50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1組無統(tǒng)計學(xué)差異；95%醇提物各劑量組大鼠與模型組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。各組大鼠乳房直徑及乳頭高度測量結(jié)果見表2。

表2 不同溶媒提取物對乳腺增生大鼠乳頭直徑及高度的影響(n=10，±s )Tab 2 Effect of different extract on the teats height and diameter in hyperplasia of mammary gland rats(n=10,±s )

表2 不同溶媒提取物對乳腺增生大鼠乳頭直徑及高度的影響(n=10，±s )Tab 2 Effect of different extract on the teats height and diameter in hyperplasia of mammary gland rats(n=10,±s )

注：與模型組相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與正常組相比，3)P＜0.05Note: Compared with model group,1)P＜0.05,2)P＜0.01; compared with normal group,3)P＜0.05

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3.2 各組大鼠乳腺病理組織學(xué)改變比較

正常組大鼠乳腺組織無增生現(xiàn)象，模型組大鼠乳腺組織中，腺泡擴張，數(shù)量增多，分泌現(xiàn)象明顯，腺泡上皮出現(xiàn)增生，小葉內(nèi)纖維組織明顯增多。乳癖消片治療后，乳腺腺泡數(shù)目減少，腺泡開始萎縮，導(dǎo)管管腔變小，增生情況得到改善；給藥30 d后，水提物各劑量組大鼠乳腺增生程度明顯改善，小葉數(shù)、平均腺泡數(shù)明顯減少、腺泡直徑及數(shù)量、腺腔內(nèi)分泌物明顯減少；且相對于乳癖消組腺泡分泌現(xiàn)象改善更明顯。50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1組大鼠乳腺增生程度減輕，小葉數(shù)、平均腺泡數(shù)明顯減少；而50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1組大鼠乳腺增生程度只有個別大鼠乳腺增生程度減輕；95%醇提物各劑量組大鼠，乳腺增生程度出現(xiàn)個別減輕現(xiàn)象。乳腺組織病理改變顯微觀察圖見圖1。

對各組大鼠乳腺增生程度進行分級積分統(tǒng)計，結(jié)果顯示模型組平均積分與正常組相比顯著升高(P＜0.01)；乳癖消組、水提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1組與模型組相比，大鼠乳腺增生程度有所減輕，平均積分與模型對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而水提物3.44 g·kg-1·d-1組平均積分與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)；50%醇提物0.86 g·kg-1·d-1及1.72 g·kg-1·d-1組平均積分均小于乳癖消組積分，但無統(tǒng)計學(xué)差異，而50%醇提物3.44 g·kg-1·d-1組平均積分與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；95%醇提物各劑量組與模型組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。各組大鼠乳腺增生程度分級積分表見表3。

表3 不同溶媒提取物對大鼠乳腺增生病理組織學(xué)評級的影響(n=10)Tab 3 Effect of different extract on pathological change of mammary gland in hyperplasia of mammary gland rats(n=10)

3.3 不同溶媒提取物乳腺增生大鼠對體重及臟器指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量有所減小，胸腺指數(shù)明顯減小(P＜0.05)，子宮指數(shù)顯著增大(P＜0.05)；與模型組相比，水提物各劑量組體質(zhì)量均有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異，而胸腺指數(shù)均有顯著性增加(P＜0.05)，子宮指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，脾臟指數(shù)均無顯著差異；50%醇提物各劑量組及95%醇提物各劑量組大鼠胸腺指數(shù)、腎臟指數(shù)及子宮指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果見表4。

4 討論

乳腺增生病又稱乳腺結(jié)構(gòu)不良，以乳房疼痛和乳房腫塊為特征，是女性常見、多發(fā)疾病，病變是以乳腺固有組織增生為主的非炎癥性、非腫瘤性病變，主要包括乳痛癥、乳腺病、乳腺纖維囊性增生[4]。近年來其癌變率有逐年升高的趨勢。目前尚無特效治療藥，西醫(yī)治療多用激素治療，能暫時緩解癥狀，但不良反應(yīng)大，長期服用療效不確切，局部手術(shù)切除卻不易為患者接受，又易復(fù)發(fā)。近年來中醫(yī)藥治療本病取得了長足的進展，具有臨床療效確切和不良反應(yīng)小的優(yōu)點，展示了良好的發(fā)展前景。許多研究表明[5-8]，中藥復(fù)方制劑對乳腺增生病具有良好的治療作用。

疏乳消塊方由柴胡、當(dāng)歸、香附、郁金等中藥組成，是蘭州大學(xué)第一醫(yī)院協(xié)定處方，臨床應(yīng)用40多年已取得了較好的臨床治療乳腺增生的效果。前期研究表明[2]，疏乳消塊丸對大鼠乳腺增生有明顯的治療作用，其機制可能是通過調(diào)整體內(nèi)激素水平，抑制胸腺指數(shù)降低，間接作用于乳房，從而起到治療作用。為了對該處方進行新劑型開發(fā)，本實驗考察了不同溶媒提取物對大鼠乳腺增生的治療作用，確定了疏乳消塊方的藥效提取物。實驗結(jié)果表明，水提物不同劑量組對大鼠乳腺增生有明顯的治療作用，能不同程度的抑制乳腺增生，減少乳腺小葉和腺泡數(shù)量，且能不同程度的影響臟器指數(shù)；50%醇提物高劑量對大鼠乳腺增生也有明顯治療作用，中、低劑量則無明顯治療作用；95%醇提物各劑量組治療效果均不明顯。因而疏乳消塊方主要藥效提取物為水提物，下一步將對該處方進行新劑型研究。

表4 不同溶媒提取物對乳腺增生大鼠臟器指數(shù)的影響(n=10，±s )Tab 4 Effect of different extract on the indexes of organs in hyperplasia of mammary gland rats (n=10,x±s )

表4 不同溶媒提取物對乳腺增生大鼠臟器指數(shù)的影響(n=10，±s )Tab 4 Effect of different extract on the indexes of organs in hyperplasia of mammary gland rats (n=10,x±s )

注：與模型組相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01；與正常組相比，3)P＜0.05Note: Compared with model group,1)P＜0.05,2)P＜0.01; compared with normal group,3)P＜0.05

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REFERENCES

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[3] ZHOU H, LONG Z J, CHEN M, et al. Influence of Kangruzeng tabet on mammary tissue of mammary gland hyperplasia models in rat [J]. Chin Tradit Pat Med (中成藥), 2008, 30(10):1536-1538.

[4] ZUO W S. Contemporary Oncology of the Breast (現(xiàn)代乳腺腫瘤學(xué)) [M]. 2ed Ed. Ji’nan: Shandong Science and Technology Press, 2006: 2382-2389.

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Therapeutic Effect of Different Extract of Shuru Xiaokuai Decoction on Hyperplasia of Mammary Glands in Rats

DUAN Haogang, WEI Yuhui, LI Boxia, QIN Hongyan, WU Xin’an*
(Department of Pharmacy, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

OBJECTIVE To observe the therapeutic effect of different extract (water, 50% ethanol and 95% ethanol) of Shuru Xiaokuai decoction on hyperplasia of mammary glands in rats, and to identify the extract with therapeutical effect. METHODS The model of hyperplasia of mammary glands was prepared in Wistar female rats. After oral administration of different extract (water, 50% ethanol and 95% ethanol) of Shuru Xiaokuai decoction, the pathologic changes of mammary gland were observed under microscope, and the morphologic changes of nipple in every group observed. RESULTS The aqueous extract at low, middle and high dosage had a significant therapeutic effect on hyperplasia of mammary gland in rats. Only extract of 50% ethanol at high dosage had therapeutic effect, and all of 95% ethanol extract had no therapeutic effect on hyperplasia of mammary gland in rats. CONCLUSION The active extract of Shuru Xiaokuai decoction on hyperplasia of mammary glands in rats were aqueous extract.

Shuru Xiaokuai decoction; hyperplasia of mammary glands; the active extract

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1058-05

2013-01-09

甘肅省衛(wèi)生廳重點中醫(yī)藥科研項目(GZK-2009-15)；蘭州市科技計重大新藥創(chuàng)制專項(2009-2-17)

段好剛，男，碩士，主管藥師 Tel: (0931)8356567 E-mail: duanhg06@163.com*

武新安，男，博士，教授，博導(dǎo) Tel: (0931)8356511 E-mail: xinanwu6511@163.com