柱前衍生-高效液相色譜法測定丙戊酸鈉血藥濃度

周春華，張志清，李飛高，亢澤坤，李敬瑄，張雪寧

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050000）

柱前衍生-高效液相色譜法測定丙戊酸鈉血藥濃度

周春華，張志清*，李飛高，亢澤坤，李敬瑄，張雪寧

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北石家莊 050000）

目的 建立柱前衍生-高效液相色譜法測定血清樣品中丙戊酸鈉的含量。方法以Diamonsil C18（4.6×250mm 5μm）為色譜柱，流動相為甲醇-水（87∶13，V/V），檢測波長為245nm；流速為1.0mL/min；柱溫25℃。樣品酸化提取后經(jīng)α-溴代苯乙酮衍生化后分析，環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 3，線性范圍15.0～180.0μg/mL，平均回收率為103.2％，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于10％，最低檢出濃度為0.3μg/mL。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確，適合于臨床血藥濃度監(jiān)測。

丙戊酸；色譜法，高壓液相；血藥濃度

丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）是臨床上常用的抗癲癇藥物［1］，當(dāng)其血藥濃度＞100μg/mL時，其不良反應(yīng)增加而療效無明顯增加，是血藥濃度監(jiān)測的常檢藥物，有效血藥濃度為50～100μg/mL，血藥濃度與療效及毒性反應(yīng)密切相關(guān)，是需進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測的藥物之一［2-4］。由于VPA在紫外區(qū)無特征吸收，不易直接檢測，臨床上常用氣相色譜測定，但存在萃取過程藥物揮發(fā)的問題。近年來，采用柱前衍生-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法衍生化測定VPA血藥濃度的報道［5-6］也較多，但多采用的衍生化試劑、條件及方法各不相同。本研究采用α-溴代苯乙酮為衍生化試劑，環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)，衍生化過程較簡易快速，紫外條件下測定顯示，樣品及內(nèi)標(biāo)峰性良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，該方法適用于VPA血藥濃度常規(guī)監(jiān)測。

1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀，包括Empower Pro工作站，Waters-515泵；Waters-486紫外檢測器；7725i進(jìn)樣閥（RHEDYNE）；電子天平（Sartorius，CPA2250）；離心機(jī)（LD5-10，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；渦旋混合器（XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；數(shù)控恒溫水浴（氮吹儀專用，KL512J，北京康林科技有限責(zé)任公司）。抽濾泵（AP-01P，天津市協(xié)同儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-300B，昆山市超聲儀器有限公司）。

丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（批號100963-201101，中國食品藥品檢定研究院）；α-溴代苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品（批號LA50LO9，瑞士J＆K Scientific公司）；環(huán)己烷羧酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號LU70L15，瑞士J＆K Scientific公司）；甲醇（批號120301，色譜純，天津康科德科技有限公司）；乙腈（批號101203，色譜純，天津市康科德科技有限公司）；正己烷（批號20091118，分析純，宜興市試劑二廠）；氨水（批號20031018，分析純，張家口市化學(xué)試劑廠）；三乙胺（批號20111220，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；硫酸（批號19981116，分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）；蒸餾水（自制，二次蒸餾）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［5］：色譜柱DiamonsilTMC18柱（250mm×4.6mm，5μm，XB-C18）；流動相甲醇-水（87∶13，V/V）；流速1.0Ml/min；檢測波長245nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL；內(nèi)標(biāo)物環(huán)己烷羧酸。

2.2 溶液的制備：儲備液配制，精密稱取丙戊酸鈉200mg，加入25mL容量瓶中，蒸餾水定容，作為丙戊酸鈉儲備液。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，取丙戊酸鈉儲備液適量，用蒸餾水稀釋成濃度分別為150、300、450、750、1 000、1500、1 800mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液配制，精密稱取環(huán)己烷羧酸12.8mg，加入100mL容量瓶中，0.5mol/L氨水定容，搖勻，得濃度為123.90mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

衍生劑溶液的配制，精密稱取α-溴代苯乙酮250mg，加入25mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，得濃度為10.00g/L的衍生劑溶液。

2.3 血清樣品處理：取血清常溫下融化，精密吸取180μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液200μL和1mol/L硫酸200μL，混勻，加提取液正己烷3mL渦旋混合2min，離心（4 000r/min）5min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相2.5mL至玻璃離心管中，加入20μL三乙胺和20μL衍生劑溶液，水浴氮?dú)獯蹈桑ㄋ囟?0℃），加入100μL甲醇溶解后進(jìn)樣。

2.4 專屬性考察：按“2.3”項(xiàng)方法操作制備血清樣品進(jìn)樣測定。在選定色譜條件下VPA與內(nèi)標(biāo)完全分離，VPA和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為8.5min和6.5 min且分離良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清；B.血清模擬樣品；C.給藥后血清樣品；1.內(nèi)標(biāo)；2.丙戊酸鈉Figure 1 HPLC chromatogram A.Blank plasma；B.Blank plasma with sodium valproate；C.Plasma sample；1.Internal standard；2.Sodium valproate

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取空白血清常溫下融化，精密吸取180μL，加入系列濃度的丙戊酸鈉溶液20μL，內(nèi)標(biāo)溶液200μL，1mol/L硫酸200μL，混勻，使血清中丙戊酸鈉的濃度依次為15、30、45、75、100、150、180mg/L，加入提取液正己烷3mL，渦旋混合2min，離心（4 000r/min）5min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相2.5mL至玻璃離心管中，加入20μL三乙胺和20μL衍生劑溶液，水浴50℃放置10min，氮?dú)饬鞔蹈桑尤?00μL甲醇復(fù)溶后進(jìn)樣。測得的丙戊酸鈉峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）對血清藥物濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.009 38C+0.024 72，（線性范圍為15～180mg/L，r=0.999 3）。

2.6 精密度試驗(yàn)：日內(nèi)精密度，取空白血清180μL，分別加入低（300mg/L）、中（750mg/L）、高（1 500mg/L）3種濃度的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，使血清藥物濃度分別為30、75、150mg/L。按血清樣品處理方法處理并測定，記錄色譜峰面積。一日內(nèi)重復(fù)配制并測定5次，并計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）值。

日間精密度，取空白血清180μL，加入低（300mg/L）、中（750mg/L）、高（1 500mg/L）3種濃度的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，使血清藥物濃度分別為30、75、150mg/L。按血清樣品處理方法處理并測定。連續(xù)測定5d，并計算日間RSD值。

低、中、高3個濃度血清樣品的日內(nèi)及日間精密度結(jié)果見表1。RSD在15.00％以內(nèi)，結(jié)果表明，丙戊酸鈉溶液在5d內(nèi)穩(wěn)定，本法精密度較好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision test

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：低溫保存穩(wěn)定性，按“2.6”項(xiàng)制備低、中、高濃度血清樣品，于-40℃低溫保存5d，按血清樣品處理方法處理并測定，計算RSD。丙戊酸鈉血清樣品低溫保存穩(wěn)定性結(jié)果見表2。結(jié)果表明低溫保存對測定結(jié)果無影響。

反復(fù)凍融穩(wěn)定性，按“2.6”項(xiàng)制備低、中、高濃度血清樣品，反復(fù)凍融3次后按血清樣品處理方法處理并測定，計算RSD。丙戊酸鈉血清樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性結(jié)果見表2。結(jié)果表明，反復(fù)凍融對測定結(jié)果無影響。

處理樣品放置穩(wěn)定性，按“2.6”項(xiàng)制備低、中、高濃度血清樣品，按血漿樣品處理方法處理后。分別于0，1，2，3，4h進(jìn)行測定，計算RSD。處理樣品低溫保存穩(wěn)定性結(jié)果見表2，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.42％，結(jié)果表明處理樣品后放置一定時間對測定結(jié)果無影響。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of stable test

2.8 回收率試驗(yàn)：按“2.6”項(xiàng)制備低、中、高濃度血清樣品。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度，并與實(shí)際濃度比較得方法回收率。低、中、高3種濃度模擬血清樣品的回收率97.36％～107.10％之間，RSD均在在3.4％以下，結(jié)果見表3。

表3 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery test（n=3）

3 討論

本研究采用高效液相色譜法紫外檢測器測定血藥濃度，選用與VPA的結(jié)構(gòu)相似物環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)［3］，該方法進(jìn)樣量小，樣品處理簡單，雜質(zhì)干擾少，方法靈敏度高，可作為VPA血藥濃度測定方法。

本研究根據(jù)相似相容原理，分離提取過程采用正己烷為提取液，且正己烷為重蒸過的，可使提取率達(dá)到最高而且穩(wěn)定。丙戊酸分子結(jié)構(gòu)中不含有紫外特征吸收基團(tuán)，不能用高效液相色譜法直接測定，因此，將其連接上有紫外吸收的基團(tuán)是本研究的關(guān)鍵：在三乙胺的催化下，α-溴苯乙酮與丙戊酸及內(nèi)標(biāo)環(huán)己烷羧酸發(fā)生衍生化反應(yīng)，三乙胺作為催化劑能中和反應(yīng)中生成的溴化氫，阻止反應(yīng)向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，使VPA酯化完全；同時也可作為改性試劑，起到改善色譜峰峰形的作用［6］。流動相為甲醇和水，不需使用緩沖液等鹽類物質(zhì)，有利于保護(hù)色譜柱。

VPA是常用的廣譜抗癲癇藥，VPA進(jìn)入人體后，轉(zhuǎn)變成丙戊酸而發(fā)揮作用，故服用VPA后血藥濃度監(jiān)測以丙戊酸濃度為準(zhǔn)。目前，丙戊酸常用的血清藥物濃度監(jiān)測方法有HPLC法和FPIA法。相對于FPIA法的儀器昂貴、試劑盒保質(zhì)期短等缺點(diǎn)，HPLC法的準(zhǔn)確、儀器試劑便宜易得等優(yōu)點(diǎn)，更適合一般醫(yī)院的臨床血藥濃度檢測工作。

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（本文編輯：趙麗潔）

表2 2組依從性及痛苦程度比較（n=110，例數(shù)，％）

3 討論

3.1 心理干預(yù)有利于提高患者依從性并減輕焦慮、抑郁情緒及痛苦：觀察組實(shí)施了心理干預(yù)，使患者手術(shù)前后的焦慮、抑郁情緒明顯減輕或消失；而對照組術(shù)前、術(shù)后變化不明顯，雖有所改善，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2組在健康教育達(dá)標(biāo)率以及患者的依從性和術(shù)后痛苦程度上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明運(yùn)用心理干預(yù)可有效地減輕鼻腔手術(shù)患者的焦慮、抑郁情緒，減輕術(shù)后痛苦，并可提高其依從性。

3.2 心理干預(yù)有利于培養(yǎng)護(hù)理人員服務(wù)理念：本研究強(qiáng)化了責(zé)任護(hù)士應(yīng)具備豐富的專業(yè)知識、心理護(hù)理方面的知識以及道德修養(yǎng)。應(yīng)具有愛心、誠心、熱心及責(zé)任心，站在患者的角度理解患者的感受，樹立為患者著想的服務(wù)理念。

3.3 非語言性干預(yù)在心理干預(yù)中的作用不可忽視：語言與肢體語言的配合，特別是手的觸摸能帶來積極效果，促進(jìn)人與人之間的溝通交往。通過觸摸人體分泌一種有助于放松的激素，從而消除緊張；觸摸還會增加機(jī)體后葉催產(chǎn)素的分泌，此激素使人產(chǎn)生愛、信任和親密的感覺，是一種無聲的語言，是一種很有效的溝通方式，觸摸可以表達(dá)關(guān)心、體貼、理解、安慰和支持［6］。

3.4 心理干預(yù)是健康教育中重要的一環(huán)：在護(hù)患溝通方面也提出更高的要求，通過對患者進(jìn)行有效的心理干預(yù)，可減輕患者的焦慮、緊張情緒，調(diào)動其主觀能動性，使之能夠積極配合治療。同時通過有效溝通，使護(hù)患關(guān)系得到改善。護(hù)士的服務(wù)更加主動周全［7］。

3.5 心理干預(yù)應(yīng)貫穿于整個護(hù)理過程：心理干預(yù)非一蹴而就，應(yīng)貫穿全程；溝通時要把握好時機(jī)，在患者需要時進(jìn)行，否則達(dá)不到滿意效果。在醫(yī)療技術(shù)相對發(fā)達(dá)、高學(xué)歷人才濟(jì)濟(jì)的今天，醫(yī)院與醫(yī)院之間的差距并不在一些硬件設(shè)施的配備上，而在于軟件即醫(yī)護(hù)人員的服務(wù)水平［8］。我們通過對患者術(shù)前、術(shù)后進(jìn)行有針對性的心理干預(yù)，既能緩解患者的焦慮、抑郁情緒，又可提高患者的依從性，保證了健康教育的有效性，值得在臨床上推廣應(yīng)用。

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（本文編輯：趙麗潔）

DETERM INATION OF SODIUM VALPROATE IN SERUM BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AFTER PRE-COLUMN DERIVATIZATION

ZHOU Chunhua，ZHANG Zhiqing*，LIFeigao，KANG Zekun，LIJingxuan，ZHANG Xuening
（Department of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical Uniuersity，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To establish amethod for determining sodium valproate in serum by high performance liquid chromatography（HPLC）after pre-column derivatization.M ethods The analytical column was Diamonsil C18 column（250mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase consisted ofmethanolwater（87∶13，V/V）at the flow rate of1.0mL/min.The detection wave length was set at245nm and the column temperature was set at 25℃.The samples were extracted after being acidified，then derived with α-bromoacetophenone before analysis.Cyclohexane carboxylic acid was used as the internal standard. Results The liner correlation of the standard curvilinear equation was r=0.999 3 with a linear range of 15.0-180.00μg/mL.Themean relative recovery was 103.2％.The intra-day and the inter-day relative standard deviation were less than 10％.The lowest limit of detection of valproate was 0.3μg/mL. Conclusion This method was convenient and accurate for the blood concentration monitoring of therapeutic drugs.

valproic acid；chromatography，high performance liquid；plasma concentration

R969.11

A

1007-3205（2013）11-1422-04

2013-06-16；

2013-08-03

2012年河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計劃（20120082）

周春華（1980-），男，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥師，理學(xué)碩士，從事藥動學(xué)及臨床藥學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：zhangzhq@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.11.023